目的:肝细胞肝癌(HCC)是原发性肝癌中最为常见的类型,近年来发病率和死亡率逐渐增加。而另一重要公共健康问题糖尿病的发病率也逐年升高。研究表明,糖尿病是HCC发病的独立危险因素,虽然已知二者间存在多种共同的危险因素,但是其具体的内在联系机制尚未明确。本课题组前期自不同糖浓度干预的人肝细胞癌细胞系HepG2细胞中提取了较为纯化的内质网,后运用蛋白组学方法对分离得到的内质网进行质谱分析,从而得到了差异表达的内质网相关蛋白39个。本研究拟通过生物信息学分析及体外细胞实验等方法,探索合并糖尿病的肝细胞肝癌患者预后较差的机制,从内质网角度出发,筛选可能在高糖促进肝细胞肝癌进展过程中起重要作用的新型蛋白,并研究高糖调控该蛋白表达的途径,以期为临床肝癌合并糖尿病患者的治疗提供可能的干预靶点。方法:1、利用GEPIA数据库检索及Pubmed文献阅读的方法,自课题组前期蛋白组学分析所得的差异表达蛋白中筛选候选目的蛋白(FKBP3、FAM98A及RRBP1)。2、体外培养HepG2细胞,RT-q PCR验证不同糖浓度(5.5mmol/L,25mmol/L)条件下HepG2细胞中候选蛋白的mRNA表达水平,进一步筛选表达有显著差异的作为研究对象(RRBP1)。3、利用TCGA数据库检索及生信分析的方法,分析RRBP1在肝癌和癌旁组织中的表达差异,以及RRBP1的差异表达可能激活的信号通路。4、体外培养HepG2细胞,不同糖浓度(5.5mmol/L,25mmol/L)干预细胞,CCK8、划痕及Transwell验证高糖对HepG2细胞增殖、迁移及侵袭的影响;Western blot验证不同糖浓度干预后RRBP1蛋白在HepG2细胞中的表达差异。5、体外培养HepG2细胞,不同条件干预细胞,分为低糖组、高糖组、高糖+NC-siRNA组及高糖+RRBP1-siRNA组,CCK8、划痕及Transwell验证高糖状态下敲减RRBP1对肿瘤细胞增殖、迁移及侵袭的影响。6、PROMO及Jaspar网站预测RRBP1可能的上游转录因子,利用GEPIA数据库检索及Pubmed文献阅读的方法,筛选候选转录因子。7、体外培养HepG2细胞,不同糖浓度干预细胞,RT-q PCR及Western blot验证不同糖浓度下HepG2细胞中候选蛋白的mRNA及蛋白表达水平,进一步筛选表达有显著差异的因子作为研究对象(E2F1)。8、Ch IP及双荧光素酶报告基因检测验证E2F1对RRBP1基因的转录调控作用。9、体外培养HepG2细胞,不同条件干预细胞,分为低糖组、高糖组、高糖+NC-siRNA组及高糖+E2F1-siRNA组,RT-q PCR及Western blot验证各组细胞中RRBP1的mRNA及蛋白表达水平;CCK8、划痕及Transwell验证高糖状态下敲减E2F1对肿瘤细胞增殖、迁移及侵袭的影响。10、挽救实验验证E2F1/RRBP1通路在HepG2细胞增殖及转移过程中的作用。结果:1、高糖组HepG2细胞中RRBP1的mRNA和蛋白表达水平显著高于低糖组。2、TCGA数据库检索及生信分析显示:RRBP1在肝癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织;RRBP1高表达组与低表达组相比有502个基因出现差异表达,KEGG富集分析显示:这些差异表达基因可以显著富集在与糖尿病和肿瘤发生密切相关的通路中;GSEA基因富集分析显示:细胞周期、DNA修复等与癌症相关的通路在RRBP1高表达组中被激活。3、CCK8、划痕及Transwell实验显示:高糖组HepG2细胞的增殖、迁移及侵袭能力明显高于低糖组,而向高糖组细胞中转染RRBP1-siRNA后,细胞的增殖、迁移及侵袭能力明显下降。4、通过PROMO及Jaspar网站预测、GEPIA数据库检索、文献阅读、RT-q PCR及Western blot实验验证,选定E2F1为可能的RRBP1上游转录因子进行后续实验。5、高糖组HepG2细胞中E2F1的mRNA和蛋白表达水平显著高于低糖组。6、Ch IP及双荧光素酶报告基因检测显示:E2F1可以与RRBP1基因的启动子序列结合,并促进RRBP1的转录。7、向HepG2细胞中转染E2F1-siRNA后,RRBP1的mRNA及蛋白表达水平显著下降。8、CCK8、划痕及Transwell实验显示:向高糖组HepG2细胞中转染E2F1-siRNA后,细胞的增殖、迁移及侵袭能力明显下降。9、挽救实验显示:E2F1可以通过上调RRBP1的表达促进HepG2细胞的增殖和转移。结论:高糖可以通过上调转录因子E2F1的表达水平促进内质网蛋白RRBP1在HepG2细胞中的表达,进而通过调控细胞周期和促进DNA修复的方式增强HepG2细胞的增殖、迁移和侵袭能力。通过本研究发现,E2F1/RRBP1途径是高糖促进HCC发生发展的机制之一,有望成为HCC合并糖尿病治疗的一个新靶点。