【摘 要】
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血栓性疾病是威胁人类健康的主要成人病之一,其中急性心肌梗塞（AMI）患者由于冠脉血管会在短时间内被血栓阻塞而具有高猝死率。目前AMI患者可通过PCI治疗或溶栓治疗去除血栓恢复
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血栓性疾病是威胁人类健康的主要成人病之一,其中急性心肌梗塞（AMI）患者由于冠脉血管会在短时间内被血栓阻塞而具有高猝死率。目前AMI患者可通过PCI治疗或溶栓治疗去除血栓恢复冠脉血流,但由于现存医疗资源分布不平衡的问题PCI治疗无法实现对我国约750.2万AMI患者的及时救治,因此发现新型溶栓物质或者新型溶栓机理可能在急性心肌梗塞患者溶栓治疗领域取得突破性进展。论文以海洋滩涂生物双齿围沙蚕（Perinereis aibuhitensis）为研究对象,利用硫酸铵分段盐析法及凝胶分级层析两种方式,通过系统设计纯化步骤,优化了纤溶活性蛋白酶的纯化方式和条件,研究了其酶学性质和纤溶活性,通过LC-MS/MS-MS初步解析了多肽分子结构。1.硫酸铵沉淀和凝胶层析纯化双齿围沙蚕纤溶活性蛋白酶。沙蚕经组织匀浆后冷冻离心,对上清液中蛋白进行40-60%段硫酸铵盐析浓缩,透析冻干后通过阴离子交换层析（DEAE-Sepharose FF）及疏水层析（Phenyl-Sepharose FF）纯化即可获得组分单一且具有较高酶活力的蛋白酶Asp60-D1-P1,两步层析后蛋白酶比活力分别为49.79IU/mg和231.94IU/mg,该蛋白的纯化倍数分别为4.45、20.23。2.Asp60-D1-P1具备优良的纤溶活性。40-60%段硫酸铵盐析沙蚕蛋白酶经阴离子交换色谱获得的Asp60-D1在一级层析蛋白峰中纤溶活力最高,为167.31U/mg;Asp-D1经疏水色谱二级层析获得的蛋白峰Asp60-D1-P1纤溶活力高达201.79 U/mg,两级层析蛋白峰的纤溶活力较层析前分别提高了0.91倍和1.31倍。纤维平板结果同样显示Asp60-D1-P1在第二级层析蛋白峰中水解纤维蛋白透明圈最大,纤溶活力最高。3.纤溶活性蛋白酶Asp60-D1-P1具备优良的酶学特征。Asp60-D1-P1的亲水氨基酸与疏水氨基酸总含量分别为126.282mg/g和24.182 mg/g,结合第二级疏水层析洗脱峰保留时间结果,说明Asp60-D1-P1蛋白酶具有亲水性;经Native-PAGE及SDS-PAGE综合分析发现Asp60-D1-P1由两条分子量分别为37.8KDa和6.5KDa的多肽链构成,该蛋白酶分子量约为44.5KDa,且常以三聚体的形式存在;Asp60-D1-P1在20℃-60℃下稳定,最适温度为40℃,温度超过70℃该酶失活;Asp60-D1-P1酶活力呈双S曲线,第一个活力峰出现在p H8.0,在p H6.0-11.0环境下稳定性良好,此外,该酶在碱性环境下活力更高,由此判断该酶为碱性蛋白酶;Na+,K+,Ca2+,Mg2+,Fe2+几乎不影响Asp60-D1-P1活性,而Fe3+可明显抑制该酶活性。4.Asp60-D1-G1鉴定为双齿围沙蚕丝氨酸类纤溶活性蛋白酶。基于LC-MS-MS检测及uniprot＿Perinereis＿210＿20190813.fasta数据库匹配结果,Asp60-D1-P1由Native-PAGE分离得到的44.5KDa、130KDa条带酶解样品（Mr＿44.5与Mr＿130）多肽片段具有95%的相似度,吻合着Asp60-D1-P1以三聚体形式存在的推测。Mr＿44.5与Mr＿130样品的酶解片段R.LSTDACQGDSGGPLVVK.D、R.TAVVSGWGTLR.S与纤溶酶部分片段相匹配,其中,R.LSTDACQGDSGGPLVVK.D的二级图谱匹配度高达95%,且含丝氨酸结构域,初步鉴定Asp60-D1-G1为双齿围沙蚕来源的丝氨酸类纤溶活性蛋白酶。论文系统研究了双齿围沙蚕纤溶活性蛋白酶,确定了纤溶活性蛋白酶的硫酸铵沉淀和凝胶层析纯化方式、优良的酶学性质及丝氨酸类纤溶活性蛋白酶的结构特征。另外,论文选用紫外分光光度法与纤维平板法双定性定量纯化蛋白酶的纤溶活力,是相互验证的纤溶活力测定方式。
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