论文部分内容阅读
CRISPR/Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein)来源于细菌抵抗外源病毒和DNA的获得性免疫系统,目前应用较为广泛的是II型CRISPR/Cas9系统。在sgRNA介导下,Cas9通过碱基互补配对识别并切割基因组特定的DNA序列,造成基因组双链断裂,然后细胞通过非同源末端连接(NHEJ)引入特异性位点突变,或者通过同源重组修复(HDR)、微同源末端连接(MMEJ)等方式将特定片段插入或者替换到特定位点上,实现基因编辑。但使用传统的CRISPR/Cas9系统进行基于HDR的特定位点修复的效率普遍较低,有待开发更高效的HDR介导的精准修复的方法。我们通过在Cas9靶向切割基因组的同时在其切割位点附近提供修复模板,从而提高Cas9介导的HDR的效率。我们选择avidin作为招募蛋白,通过SpyTag-SpyCatcher共价标签系统把avidin连接到Cas9上形成Cas9-avidin蛋白复合体,然后把带有biotin修饰的修复模板结合到Cas9-avidin蛋白复合体上。此外我们在Cas9切割位点的上下游设计15 nt短sgRNA的识别位点,把带有修复模板的Cas9-avidin蛋白复合体通过15 nt sgRNA靶向到切割位点附近,提供修复模板进行HDR修复。结果表明,在HEK293细胞中,该方法所产生的HDR效率有少量提高,但还需要进行优化。在我们研究正在进行的过程中,Gu等报导了用类似方法在小鼠胚胎2细胞时期将HDR效率提升到95%并有效降低了脱靶率[1],证明了该方法的可行性,但该方法能否能在其他类型细胞和发育时期中达到同样高的效率,或者应用于临床疾病的治疗,还有待进一步研究。DNA结合蛋白主要参与基因组完整性的维持、染色质修饰和基因的表达调控等一系列生物学过程。ChIP-seq(Chromatin immunoprecipitation experiments followed by sequencing)技术可以在全基因组水平上研究DNA/蛋白质相互作用。然而,免疫沉淀过程中抗体或磁珠对非目的蛋白和DNA的非特异结合,会造成ChIP-seq结果的假阳性。因此,我们基于SpyTag-SpyCatcher共价标签系统对ChIP-seq技术进行了改进,即通过在转录因子等目的蛋白上引入SpyTag标签,然后通过磁珠偶联的SpyCatcher与融合了SpyTag标签的蛋白进行SpyTag-SpyCatcher共价交联反应,将目标DNA/蛋白复合体特异性地富集下来。这种共价交联能够经受高浓度SDS、煮沸等强变性条件的洗涤,因此可以大大减少抗体或者磁珠非特异性结合的蛋白和DNA,从而提高信噪比,我们将这种技术命名为SpyChIP-seq。结果表明,在稳转了融合有SpyTag标签的ELK4和BACH1转录因子的HEK293T细胞系中,SpyChIP-seq技术可以有效地富集目的DNA/蛋白复合体,并能承受如1%SDS等高强度变性条件的洗涤。比传统ChIP-seq的信噪比显著提高,对motif的富集倍数也更高,证明了SpyChIP-seq方法具有高信噪比的优点。