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目的:观察AG490对人脂肪细胞增殖以及对高浓度瘦素作用下人脂肪细胞脂质代谢的影响,了解AG490对脂肪细胞直接作用存在与否;探讨JAK/STAT通路在瘦素抵抗形成中的作用。方法:(1)无菌取人腹部皮下脂肪,采用胶原酶消化法分离出前脂肪细胞进行培养,待细胞融合后诱导分化为脂肪细胞,光镜下观察细胞的形态学变化并经油红O对细胞内脂质染色进行细胞鉴定后培养于培养液A中,置入37OC、5%CO2条件下培养达到试验要求后随机分组进行试验。(2)AG490对人脂肪细胞增殖的影响:A、不同剂量AG490对人脂肪细胞生存的影响:将人脂肪细胞调制成3×104/ml细胞悬液,加入96孔培养板中,100ul/孔,置37OC、5%CO2条件下培养16h至细胞贴壁后,再加入不同浓度的AG490(5、10、15、20umol/L)进行干预,每组3个复孔,培养24h,用MTT法检测细胞增殖情况,并用培养液A作对照;B、AG490作用不同时间对人脂肪细胞增殖的影响:方法同前,AG490的剂量同上,作用时间分别为1、2、3、4d,并用培养液A作对照。(3)AG490对高浓度瘦素作用下人脂肪细胞脂质代谢的影响:脂肪细胞按5×104/ml的浓度接种于24孔培养板,置37OC、5%CO2条件下培养16h,至细胞贴壁后分组:1、高浓度瘦素对照组;2、AG490干预组:A、AG490 5umol/L;B、AG490 10umol/L;C、AG490 15umol/L,D、AG490 20umol/L(见表2.1)。置37OC、5%CO2条件下培养24h、48h、72h,分别收集各组培养液检测游离脂肪酸和甘油的浓度。(4)对各组参数进行统计学分析。结果: (1)成功分离并培养人前脂肪细胞,观察了它们的增殖以及诱导分化过程:细胞增殖期内的4-10d为对数增长期;分化培养的第4d细胞内可见脂质小滴并逐渐增多,21d左右大部分分化为成熟脂肪细胞;成熟脂肪细胞传代时间为3-4天。(2) MTT法检测结果显示5umol/L,10umol/L,15umol/L,20umol/LAG490对脂肪细胞的增殖无影响,不同浓度AG490作用1、2、3、4d,MTT法检测各浓度AG490组细胞增殖与对照组相比无显著差异。(3)游离脂肪酸铜抽提法测定实验组培养液中游离脂肪酸浓度,观察分别在5umol/L,10umol/L,15umol/L,20umol/LAG490干扰下,高浓度瘦素环境脂肪细胞培养液游离脂肪酸变化:①作用24h时,较对照组分别增加了33.6%、35.6%、37.1%、37.5%;作用48h时,较对照组分别增加了28.0%、33.9%、54.6%、54.4%;作用72h时,较对照组分别增加了45.8%、63.0%、98.7%、100.1%。说明在不用时间点上,各浓度AG490组细胞培养液中游离脂肪酸与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。采用GPO Trinder酶学反应,通过比色测定实验组培养液中甘油浓度;观察分别在5umol/L,10umol/L,15umol/L,20umol/LAG490干扰下,高浓度瘦素环境脂肪细胞培养液甘油变化:②作用24h时,较对照组分别增加了46.9%、56.4%、79.9%、80.6%;作用48h时,测定各组细胞培养液甘油含量较对照组分别增加了18.7%、23.1%、44.2%、43.7%;作用72h时,测定各组细胞培养液甘油含量较对照组分别增加了15.1%、23.8%、28.5%、31.4%。说明在不用时间点上,各浓度AG490组细胞培养液中甘油与对照组相比,差异也具有统计学意义(P<0.05)。③AG490 15umol/L浓度组与AG490 20umol/L浓度组两组间游离脂肪酸和甘油相比,不存在统计学差异(P>0.05)。结论: (1)成功地提取和培养了人腹部皮下前脂肪细胞以及顺利诱导分化为脂肪细胞,为研究各种激素和药物等对脂肪细胞的作用提供了实验细胞模型。(2)实验结果显示AG490对正常脂肪细胞增殖无明显影响,推测AG490对脂肪细胞代谢无直接作用。(3)AG490可以干扰瘦素对脂肪细胞脂质代谢影响作用,并具有时间和剂量依赖性。