论文部分内容阅读
目的:研究重金属铅对睾丸间质细胞的损伤作用，定位到线粒体，阐明其毒理作用机制，为临床男性性功能低下的治疗提供实验依据。方法:以100uM浓度的醋酸铅作用于睾丸间质细胞株R2C，加入25μM的羟基胆固醇作为孕酮合成底物，在1、3、6、12和24h分别收取正常和铅暴露细胞样品，应用放射免疫学技术检测培养上清中孕酮的含量；应用Real time RT-PCR和Western blot的方法验证孕酮合成相关酶的表达水平；应用流式细胞仪技术检测线粒体膜电位，并以透射电镜的技术观察线粒体形态学变化；应用ELISA的方法检测细胞内的cAMP水平，并通过Western blot的方法检测cAMP-PKA/PKC-ERK1/2通路上相关蛋白的表达及其磷酸化水平，最后又通过免疫荧光技术检测了MEK/ERK与线粒体共定位的变化。结果:对比同一时间点的正常对照组，重金属铅（100μM）使R2C细胞培养上清中的孕酮含量明显减少，并呈现时效关系，在12h（P<0.01）与24h（P<0.001）具有统计学差异。检测孕酮合成相关酶的基因和蛋白表达水平结果显示，StAR基因表达从1h开始就出现明显的下调趋势，CYP11A1基因表达从6h开始出现明显的下调趋势，而3β-HSD基因表达从3h开始出现明显的下调趋势；StAR蛋白从1h开始就出现明显的下调趋势，CYP11A1蛋白从1h就开始下调，3β-HSD蛋白从12h开始出现明显的下调趋势。流式细胞仪技术检测结果显示，重金属铅作用1h就能够观察到线粒体膜电位降低9.37%，随后3和6h略有回升，接着在12h和24h保持下降10%的水平，与正常组比较均具有统计学差异。电镜结果发现醋酸铅作用1h开始就发生了损伤，直到24h呈现时间效应关系。cAMP-PKA/PKC-ERK1/2信号通路相关蛋白检测显示，铅暴露使细胞内cAMP水平自1h开始显著下降，PKA和PKC表达下降，ERK和MEK蛋白磷酸化水平也相应显著下调。免疫荧光结果发现重金属铅作用后，MEK/ERK与线粒体共定位减少。结论:重金属铅能够抑制睾丸间质细胞分泌孕酮的功能，能够在基因和蛋白水平上抑制孕酮合成关键酶StAR、CYP11A1和3β-HSD的表达。铅导致线粒体发生损伤，使线粒体膜电位下降。重金属铅对睾丸间质细胞的毒理作用与cAMP-PKA/PKC-ERK1/2信号通路的抑制密切相关。铅促使睾丸间质细胞内cAMP水平下降，cAMP的下降同时抑制PKA和PKC的蛋白表达，显示PKA和PKC都同时参与了该类固醇激素合成通路；PKA/PKC的下调抑制了MEK1/2和ERK1/2的磷酸化，进而影响StAR的活化，抑制孕酮的合成和分泌。这一机制的提出为部分因雄激素缺乏而导致的男性功能衰减的治疗和男性性腺功能衰退的治疗提供了实验依据。