FLP是一种DNA特异位点重组酶（Site Specific Recombinase SSR）,可在无辅助因子存在的前提下对重组酶特异识别位点（Recombination target sites, RTS）Frt之间基因片段进行置换、倒置和删除等操作。FLP/Frt系统自上世纪80年代首次发现以来,已广泛应用于各种生物的基因敲除、基因敲入、点突变、缺失突变、染色体组大片段删除等基因工程操作。相对其它DNA特异位点重组酶,FLP的细胞毒性相对较低,对细胞伤害小。但FLP介导的重组效率往往受到其在细胞中表达量较低的限制。穿膜蛋白Tat是一种无需辅助条件便能携带大分子物质穿透多种细胞膜的蛋白。通过体外表达融合蛋白Tat-FLP,将其以一种浓度依赖的方式高效快速地将FLP导入细胞内,能够有效解决FLP重组效率受到细胞自身表达量高低限制的问题。本研究拟应用原核表达系统表达细胞穿透性的重组酶Tat-FLP,以建立高效稳定的Tat-FLP原核表达与纯化体系。本研究主要分为以下三个部分：首先,以质粒pCAGGS-FLPe为模板,PCR扩增FLPe序列,将克隆到pET28a-Tat中其与穿膜蛋白Tat相连,获得表达载体pET28a-Tat-FLPe,然后将Tat-FLPe分别插入到另外三个原核表达载体pET22b、pET30a、pET32a中,转入原核表达菌Rosetta诱导表达,结果发现只有载体pET32a-Tat-FLPe可在大肠杆菌中表达出稳定的、有活性的Tat-FLPe;其次,为进一步提高Tat-FLPe的表达量,利用在线软件对Tat-FLPe的密码子进行优化,然后再克隆至表达载体pET32a中,获得表达载体pET32a-Tat-FLPe,经诱导表达,发现优化后Tat-FLPe的表达量显著提高；与此同时,本文还探索了诱导表达条件对Tat-FLPe表达的影响,发现IPTG浓度对其表达影响不大,而温度的影响较大。Tat-FLPe转化菌的最佳诱导表达条件为终浓度为0.05M IPTG,30℃诱导表达4小时。最后,采用阳离子交换柱纯化表达上清,并通过超滤脱盐,获得细胞穿透性的Tat-FLPe。将Tat-FLPe与质粒pfrt-GFP-frt共孵育,Tat-FLPe有效的切下了730bp的GFP目的条带；将Tat-FLPe与整合pfrt-GFP-frt的、发出绿色荧光的山羊胎儿成纤维细胞共孵育,Tat-FLPe有效地切去了细胞基因组中的GFP片段,细胞中的荧光淬灭。综述所述：本研究在原核表达系统中成功获得了有活性的Tat-FLPe,优化了其表达条件,并验证了Tat-FLPe的体内外活性,为其下一步应用于细胞、活体动物的基因操作奠定了基础。