颅脑创伤因为发病率高、病情变化快、致死致残率高,是医疗卫生和社会经济学的重大难题。颅脑创伤导致脑组织和细胞缺血缺氧、水肿、炎症、神经递质失调和生理性屏障受损等一系列复杂的生理生化级联反应,引起神经胶质细胞和神经元变性死亡,继而这些细胞内的特异成分和生化产物直接释放入脑组织间液和脑脊液,并通过受损的血脑屏障或其他可能途径进入血液,这些脑特异蛋白被称作生物标志物。胶质细胞纤维酸性蛋白(GFAP)和泛素C末端水解酶(UCH-L1)近年来分别被作为星形胶质细胞和神经元损伤的标志物,引起研究者的广泛关注。一些研究发现血清GFAP、UCH-L1可反映颅脑创伤后脑内损伤严重性和进展情况,与颅脑创伤病情严重程度有良好的相关性,并且稳定性、敏感度和特异度高于既往所发现的脑损伤生物标志物如神经元特异性烯醇化酶(NSE)和S100B蛋白等。因此,本课题研究从动物实验和临床研究的角度,评估血清GFAP、UCH-L1在颅脑创伤后的表达水平以及与颅脑创伤诊断预后的相关性,并以亚低温干预为手段,验证生物标志物对干预措施疗效的监测效果,从而为这些标志物在临床中应用提供参考价值。本课题分为四部分:一、大鼠液压脑损伤和常温及亚低温治疗模型的建立;二、大鼠血清GFAP、UCH-L1对低温干预疗效监测的研究;三、颅脑创伤后早期血清GFAP、UCH-L1对颅脑创伤患者预后的预测价值;四、血清GFAP、UCH-L1在颅脑创伤临床RCT试验中的初步应用。第一部分大鼠液压脑损伤和常温及亚低温治疗模型的建立目的建立稳定可重复的大鼠液压脑损伤和常温及亚低温治疗模型,从组织学和神经行为学角度评价模型质量。方法雄性SD大鼠72只(体重:348-385g)随机分配至四组:损伤常温组(n=18),损伤亚低温组(n=18),假损伤常温组(n=18),假损伤亚低温组(n=18)。对损伤亚低温组的大鼠应用液压脑损伤打击仪以1.8-2.1 ATM的压力致伤,亚低温治疗使用冰浴降温的方式将大鼠脑温控制在33℃左右(波动于32.5℃至33.5℃),维持该温度4小时后在2小时的时间采用加热灯或加热垫复温至正常体温(36-37℃)。损伤常温组则在液压脑损伤后采用加热灯或加热垫使大鼠脑温维持在正常体温。假损伤常温组仅颅骨钻孔并埋置打击管,无液压损伤,无降温操作,体温维持在36-37℃。假损伤亚低温组大鼠进行颅骨钻孔并埋置打击管,无液压损伤,接受降温和复温处理。伤后24h,各组大鼠取3只进行脑组织大体形态观察,3只脑组织行病理HE染色,6只于伤后第1-7天行横梁行走试验检测运动功能改变,6只于伤后第11-15天行Morris水迷宫检测认知功能改变。结果损伤亚低温组和假损伤亚低温的大鼠在执行冰浴降温后体温迅速下降并达到目标温度(32.5-33.5℃),在维持低温的4小时和复温的2小时内大鼠各项生理参数稳定,与其他组大鼠无明显差异。伤后24小时大体观可见假损伤常温组和假损伤亚低温组未见明显大脑皮层异常改变,而在损伤常温组和损伤亚低温组可见硬膜下出血、脑挫裂伤和蛛网膜下腔出血出血等改变,但亚低温组损伤程度明显较轻。HE染色进一步确认亚低温组的大鼠致伤灶周围皮层和海马区域损伤程度较常温组减轻。横梁行走试验和Morris水迷宫试验提示亚低温可明显改善脑损伤大鼠的运动和认知功能。结论本实验成功建立大鼠液压脑损伤常温和亚低温治疗的动物模型,结合组织学和行为学结果,亚低温可以提供脑损伤后的神经保护作用。第二部分大鼠血清GFAP、UCH-L1对低温干预疗效监测的研究目的检测亚低温对大鼠脑损伤后6h、24h血清GFAP、UCH-L1浓度和伤后24h脑组织胶质细胞和神经元数量的影响,并行相关性验证。方法采用前期成功制作的大鼠液压脑损伤常温及亚低温治疗模型,64只雄性SD大鼠随机分为四组:假损伤常温组,假损伤亚低温组,损伤常温组,损伤亚低温组(各组n=16)。各组大鼠在实验前埋置打击管后(基线)、伤后6h、伤后24h取全血500-800ul,并提取血清检测GFAP、UCH-L1浓度。伤后24h,各组大鼠中的8只取脑组织行石蜡切片GFAP免疫组化,对皮层和海马CA2/3区域的星形胶质细胞计数;另外8只脑组织行冰冻切片Fluoro-Jade B荧光染色,对皮层和海马CA2/3区域的变性神经元计数。采用Pearson相关检验分别对伤后6h、24h血清GFAP浓度与伤后24h星形胶质细胞数量做相关分析,并分别对伤后6h、24h血清UCH-L1浓度与伤后24h变性神经元数量做相关分析。结果亚低温对假损伤大鼠的血清GFAP、UCH-L1浓度无明显影响。亚低温可降低伤后6h、伤后24h血清GFAP浓度(P=0.0017和P=0.043),同时可降低伤后6h血清UCH-L1浓度(P=0.0013),可降低伤后24h血清UCH-L1浓度,但无统计学意义(P=0.162)。组织病理学显示亚低温可降低皮层和海马CA2/3区域受损胶质细胞和变性神经元的数量。相关分析结果提示伤后6h、伤后24h血清GFAP浓度均与脑内GFAP阳性细胞数量有明显相关性(伤后6h:R=-0.616,P=0.0002;伤后24h:R=-0.313,P=0.0132),伤后6h的相关程度最强。伤后6h血清UCH-L1浓度与脑内Fluoro-Jade B阳性细胞数量有相关性(R=0.365,P=0.0399),伤后24h的血清UCH-L1与脑内Fluoro-Jade B阳性细胞数量无明显相关性(R=0.272,P=0.132)。结论亚低温可降低血清GFAP、UCH-L1浓度,并可减轻脑内胶质细胞和神经元损伤。伤后6h的血清GFAP具有明显的干预措施疗效判别作用,可反应脑组织损伤和保护情况。血清GFAP在监测低温干预疗效的价值可能高于UCH-L1。第三部分颅脑创伤后早期血清GFAP、UCH-L1对颅脑创伤患者预后的预测价值目的评估颅脑创伤后早期(伤后4小时内)血清GFAP浓度对患者伤后6个月预后的预测能力。方法纳入2012年3月至2014年9月因重型颅脑创伤在上海仁济医院神经外科就诊的成年患者。纳入标准为:年龄>18周岁,性别不限,受伤时间为入院前4小时内且入院时GCS评分为3-8分。排除标准为:头部外伤合并其他系统器官的严重外伤、入院时生命体征不平稳和妊娠期妇女。此外,选取135例既往无颅脑创伤和其他神经系统疾病的健康志愿者作为对照组。抽取健康志愿者和患者入院时的外周静脉血3-5ml并提取血清检测GFAP、UCH-L1浓度。对颅脑创伤患者进行伤后6个月的随访,根据GOS评分分为死亡和存活、预后不良(死亡+植物生存+重度残疾)和预后良好(中度残疾+恢复良好)两类结局指标,并对血清GFAP、UCH-L1预测患者预后的准确性进行ROC分析。结果一共67例重型颅脑创伤患者纳入研究,平均入院时间为伤后2.6小时,GCS评分中位值为6分。伤后6个月随访时发现患者死亡27例,死亡率40.3%;预后不良患者(死亡+植物生存+重度残疾)35例,预后不良率52.2%。与健康志愿者相比,重型颅脑创伤患者入院时血清GFAP、UCH-L1浓度明显升高(均P<0.001)。ROC分析结果提示,入院时血清GFAP、UCH-L1具有预后预测价值,GFAP对死亡的预测准确度AUC=0.761,对预后不良的预测准确度AUC=0.823,血清UCH-L1对死亡的预测AUC=0.722,对不良预后的预测价值AUC=0.728。这两种血清标志物对死亡或不良预后预测的能力均高于年龄(AUC=0.592和0.617)、GCS评分(AUC=0.702和0.711)和瞳孔反应(AUC=0.655和0.705)等临床指标。结论颅脑创伤早期的血清GFAP、UCH-L1具有预后预测价值,且预测能力高于年龄、GCS评分和瞳孔反应等临床指标。第四部分血清GFAP、UCH-L1在颅脑创伤临床RCT试验初步应用目的评估血清GFAP、UCH-L1用于颅脑创伤临床RCT试验中作为替代指标的可行性。方法LTH-1试验是由中国15家三级甲等医院协同开展的前瞻性多中心随机对照研究,旨在评估长时程低温(34-35℃)治疗重型颅脑创伤(GCS 4-8分)患者的疗效和安全性。本研究选取上海仁济医院纳入并完成随访的14例重型颅脑创伤患者,收集入院时、入院后1-6天共计7天的外周静脉血并提取血清,检测GFAP、UCH-L1浓度,观察亚低温对患者血清GFAP、UCH-L1浓度的影响,并通过伤后6个月的随访数据初步了解长时程低温的疗效及血清GFAP、UCH-L1作为颅脑创伤临床RCT试验替代指标的可能性。结果自2013年11月12日至2015年9月2日,14例患者符合标准入组并完成随访,平均年龄42.25±10.3周岁,性别、入院GCS评分、致伤原因、瞳孔反应等指标在两组间无统计学差异。在伤后6天的观察时间内,两组患者的血清GFAP、UCH-L1浓度均有所降低。对比入院时,伤后第6天亚低温组患者血清GFAP浓度降低程度较常温组更为明显(ΔGFAP:2.009(0.354-3.711)vs 1.08(0.193-2.366)ng/ml,P<0.01),亚低温组患者血清UCH-L1浓度降低较常温组更多(ΔUCH-L1:0.456(0.091-0.842)vs 0.175(0.041-0.552),P<0.05)。伤后6个月随访显示亚低温和常温对照组死亡率分别为28.6%和57.2%(P=0.28)、两组不良预后率分别为42.8%和71.4%(P=0.28),但由于样本量仅14例患者,造成统计学效能不足,待多中心300例样本量全部完成后才能确定长时程亚低温的疗效。结论长时程亚低温疗法可降低患者伤后6天的血清GFAP、UCH-L1浓度,其疗效有待多中心研究完成后做出评估。