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猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2, PCV2)基因组为单链环状DNA,包含两个主要开放阅读框。ORF1编码2个与病毒复制相关的蛋白(Rep和Rep’),Rep由全长ORF1编码314个氨基酸(aa)组成,Rep’由ORF1转录剪接内含子而来,由178个aa组成。Rep与Rep’蛋白形成的复合体是病毒复制所必需的,在宿主细胞酶类分子的参与下,该病毒复制以滚环复制机制(Rolling-circle replication, RCR)完成的。由于PCV2基因组较小,编码蛋白数量有限,据此推测病毒复制需要宿主细胞酶类分子的参与,究竟宿主细胞哪类蛋白参与其中所知甚少。本研究通过酵母单杂交技术筛选宿主细胞中与PCV2复制相关的蛋白,从病毒宿主细胞-猪肾细胞株(PK-15)中初步鉴定出有4种蛋白与PCV2基因组茎环序列发生互作,这4种蛋白分别为配体相关蛋白复合体(AP2α2)、ETS相关的转录因子(Elf4)、铁硫束组装酶(ISCU)蛋白和肌动蛋白(p-actin);进一步通过蛋白过表达及RNAi技术验证这些蛋白对PCV2病毒复制的调节作用。第一、与PCV2基因组茎环结构相互作用宿主细胞蛋白的筛选。为了筛选出PK-15细胞中与PCV2基因组复制起始处茎环结构序列互作的蛋白,利用酵母单杂交技术,将合成的PCV2复制起始处的茎环结构序列整合到酵母染色体中构建诱饵酵母菌株；采用SMART技术合成PK-15细胞cDNA文库,将总cDNA与pGADT7-Rec表达载体共同转化酵母诱饵菌株,通过同源重组在酵母细胞内同步进行cDNA文库的构建,以药物筛选阳性克隆；通过酵母菌落PCR得到阳性克隆中的cDNA插入片段,序列分析确认。本实验成功地构建了酵母单杂交文库,筛选出1.01×106个酵母克隆,其中196个为阳性克隆,经PCR产物测序,并通过NCBI Blast法进行序列比对,确定有4种蛋白：包括配体相关蛋白复合体(AP2a2)、ETS相关的转录因子(Elf4)、铁硫束组装酶(ISCU)蛋白和肌动蛋白(β-actin),它们可与PCV2基因组茎环序列发生互作。从宿主细胞cDNA文库中筛选到4种可与PCV2基因组茎环序列发生互作蛋白,为下一步阐明这些宿主细胞蛋白对PCV2复制的调节作用奠定了基础。第二、三种宿主细胞源蛋白对PCV2复制的调节作用研究。为了验证PK-15细胞源蛋白(AP2α2、Elf4和ISCU)表达水平对PCV2的复制调节作用,本研究采用RT-PCR方法扩增了AP2α2、Elf4和ISCU蛋白编码基因,构建真核表达载体(pEGFP-AP2α、pEGFP-Elf4和pEGFP-ISCU);同时设计了这3种蛋白的RNAi片段(AP2a2179-200, AP2a2845-865, AP2a21511-1531, Elf447-67, Elf4156-176, Elf4906-927, ISCU99-119, ISCU201-221和1ISCU292-312),分别克隆到pGPU6-GFP载体中,构建shRNA干扰载体。采用荧光定量PCR法检测干扰效率,选取干扰效率较高的pGPU6-GFP/AP-a21511、pGPU6-GFP/ETS906和pGPU6-GFP/ISCU99干扰载体。利用G418筛选转染真核表达载体或干扰载体后的PK-15细胞。采用ELISA和免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)法,对PCV2毒株在这些细胞中的传代效率进行检测表明,Elf4蛋白和ISCU蛋白过表达能够显著增强了PCV2的复制；而AP2a2蛋白过表达对PCV2的复制无显著影响。AP2a2、ISCU和Elf4这3种蛋白基因被干扰表达后均可降低PCV2复制效率,表明这3种宿主细胞蛋白对该病毒复制具有调节作用。