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实验一线粒体促凋亡蛋白Smac在膀胱癌中的表达目的检测线粒体促凋亡蛋白(Smac)在膀胱移行上皮细胞癌(TCC)中的表达并探讨其意义。方法逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组织化学SP法分别在基因和蛋白水平检测Smac在15例正常膀胱黏膜和72例TCC中的表达。结果Smac蛋白和mRNA在正常膀胱粘膜与分化Ⅰ级TCC中均有较强表达,二者差异无统计学意义(P>0.05),在TCC中的表达随分级的增加都显著性减少(P<0.01,P<0.05)。浸润性TCC中Smac蛋白和mRNA的表达都低于表浅性TCC(P<0.01)。结论Smac在正常膀胱粘膜强表达,而在TCC中低表达,且与TCC的分级分期密切相关,提示Smac低表达是TCC发生发展的一个重要因素,Smac可望作为TCC基因治疗的靶点。实验二中国人尿路斑块蛋白Ib组织特异性研究及其启动子的克隆与鉴定目的研究中国人尿路斑块蛋白Ib(UpⅠb)的组织特异性并克隆与鉴定其启动子。方法RT-PCR检测32例膀胱癌、16例正常膀胱粘膜、15例正常小肠粘膜、16例正常食道粘膜、19例正常肾实质、20例正常肝实质、8例正常皮肤及8例正常心肌标本中UpⅠb的表达。以人正常膀胱粘膜为材料提取基因组DNA,克隆UpⅠb启动子片段,并凝胶电泳和测序鉴定。结果所有正常膀胱粘膜标本、16例分化Ⅰ级膀胱癌中有15例(93.8%)、9例分化Ⅱ级膀胱癌中有7例(77.8%)、7例分化Ⅲ级膀胱癌中有4例(57.1%)检测到UpⅠb表达,而正常食道粘膜、小肠粘膜、肾实质、肝实质、皮肤、心肌标本均未检测到UpⅠb表达。中国人UpⅠb 234bp的启动子被克隆并完成鉴定。结论中国人UpⅠb具有高度尿路移行上皮特异性,加上其启动子短小,UpⅠb启动子非常适合膀胱癌的靶向基因治疗研究。我们成功克隆出中国人UpⅠb启动子片段,为后续研究奠定了基础。实验三UpⅠb启动子调控Smac表达的真核表达质粒的构建(pcDNA3.1-UpIb promoter-Smac )目的构建携带Smac基因、人尿路斑块蛋白Ⅰb(UpⅠb)启动子调控的膀胱移行上皮特异性真核表达载体。方法切除含Smac基因的真核表达载体pcDNA3.1-Smac内部的人巨细胞病毒(CMV)和T7启动子序列,替换为在膀胱移行上皮特异表达的UpⅠb的启动子。构建的质粒经双酶切凝胶电泳及测序鉴定。结果成功构建携带Smac基因人UpⅠb启动子调控的膀胱移行上皮特异性真核表达载体pcDNA3.1-UpⅠb promoter-Smac质粒。结论新构建的载体为膀胱癌的靶向基因治疗奠定了基础。实验四pcDNA3.1-UpIb promoter-Smac的表达活性及膀胱癌特异性目的研究尿路斑块蛋白Ib(UpⅠb)启动子启动Smac表达的膀胱癌特异性及活性。方法采用RT-PCR和免疫组化方法分别检测膀胱癌细胞株BIU-87和其他多种非膀胱癌细胞株在转染含UpⅠb启动子和Smac基因的真核表达质粒pcDNA3.1-UpIb promoter-Smac前后Smac mRNA和蛋白质的表达变化。结果BIU-87在转染后Smac mRNA的表达比转染前增强约2.1倍,Smac蛋白表达阳性细胞率也由转染前的约25.6%增加为转染后的约70.5%;非膀胱癌细胞株转染前后Smac mRNA及蛋白的表达没有显著性变化。结论UpⅠb启动子启动Smac表达具有膀胱癌靶向性及相当启动活性,为膀胱癌的靶向基因治疗研究奠定了基础。实验五pcDNA3.1-UpIb promoter-Smac对培养膀胱癌细胞的促凋亡效应目的探讨转染新构建的UpIb启动子调控携Smac基因的真核表达质粒pcDNA3.1-UpIb promoter-Smac对膀胱癌细胞的促凋亡效用。方法用脂质体将质粒转染到膀胱癌BIU-87细胞系中,24小时后用RT-PCR检测Smac的表达,以低剂量丝裂霉素C诱导凋亡,利用倒置光学显微镜、Wrighs-Gimesa染色、DNA凝胶电泳技术、TUNEL-荧光标记技术及流式细胞术检测凋亡。结果丝裂霉素C处理的各组在倒置光学显微镜和Wrighs-Gimesa染色油镜下可见到典型的凋亡形态学改变,DNA凝胶电泳呈特征性的梯形条带。TUNEL-荧光标记技术及流式细胞术检测转染pcDNA3.1-UpIb promoter-Smac组凋亡率显著高于单用丝裂霉素C组。结论转染pcDNA3.1-UpIb promoter-Smac能够通过提高Smac的表达而有效促进丝裂霉素C诱导的膀胱癌细胞凋亡,提示该质粒配合凋亡诱导药物可能成为膀胱癌新的靶向基因治疗手段。实验六pcDNA3.1-UpIb promoter-Smac膀胱癌裸鼠移植瘤内注射后的表达及促凋亡效应目的探讨脂质体包裹携Smac基因的膀胱癌特异性表达质粒pcDNA3.1-UpIb promoter-Smac瘤内注射后的表达及促凋亡效应。方法用脂质体将pcDNA3.1-UpIb promoter-Smac包裹后注射到裸鼠膀胱癌移植瘤模型的瘤体内,然后瘤体内注射丝裂霉素C诱导凋亡。RT-PCR检测Smac mRNA的表达,免疫组化检测Smac蛋白的表达,苏木素伊红染色镜检、DNA Ladder带凝胶电泳分析和TUNEL-荧光标记检测观察膀胱癌细胞的凋亡。结果瘤体内注射脂质体包裹的pcDNA3.1-UpIb promoter-Smac后,Smac的表达明显增强、在丝裂霉素C诱导下的凋亡率显著提高。结论膀胱癌裸鼠移植瘤模型瘤体内直接注射脂质体包裹的pcDNA3.1-UpIb promoter-Smac后Smac基因能够有效表达并有显著的促凋亡抗肿瘤作用,为该基因治疗模式及治疗质粒的临床应用提供了依据。