论文部分内容阅读
目的：
[1]制备pcDNA3.1/HPV6b L1△/Ct MOMP[人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)6b型晚期蛋白1/沙眼衣原体主要外膜蛋白(Chlamydia trachomatis，Ct，major outer membrane protein，MOMP)]多表位嵌合质粒；
[2]建立小鼠生殖道Ct感染模型；
[3]研究HPV6b L1△/Ct MOMP多表位嵌合核酸疫苗(简称为：HPV6bL1△/CtMOMP168)免疫对小鼠生殖道Ct感染的保护作用。
方法：
[1]采用QIAGEN质粒大量提取试剂盒提取pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/CtMOMP168重组质粒，同时提取pcDNA3.1、pcDNA3.1/ Ct MOMP168DNA作为实验对照。并利用QIAGEN镍合胶制备pET32a/ CtMOMP168蛋白在Prime-boost免疫时使用；
[2]采用Hep-2细胞培养E血清型Ct(ATCC VR-348B Trachoma serotype E)并进行Ct包涵体的鉴定以及Ct纯化；
[3]小鼠生殖道Ct感染模型的建立：以106包涵体形成单位(Inclusion forming units，IFU)剂量的Ct原体(Elementary body，EB)感染BALB/c小鼠生殖道，同时Hep-2细胞感染另一组小鼠作为阴性对照。小鼠感染Ct后，通过外生殖道炎症观察、阴道分泌物PCR鉴定、阴道分泌物做细胞培养鉴定Ct IFU等证实模型是否构建成功；
[4]选择6-8周BALB/c雌性小鼠，用pcDNA3.1(+)/ HPV6bL1△/Ct MOMP168核酸免疫。同时设PBS、pcDNA3.1、pcDNA3.1/ Ct MOMP168作为对照和Prime-boost免疫策略组对照(第1次先用pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/ CtMOMP168核酸免疫，之后两次免疫用pET32a/ Ct MOMP168蛋白)，采用0、2、4周肌肉注射免疫，共免疫3次；末次免疫后第2周用106 IFU Ct EBs进行攻击小鼠生殖道。隔周采集阴道分泌物进行细胞培养、PCR鉴定以及sIgA检测，断尾取血分离血清检测IgG。初次免疫后第8周取小鼠脾淋巴细胞检测其CTL(Cytotoxcity T lymphocytes，CTL)的杀伤活性和流式细胞术分析脾淋巴细胞胞内细胞因子IFN-γ，IL-4，IL-10的分泌。并通过观察小鼠生殖道炎症和检测生殖道Ct清除率等指标来判定重组质粒组对小鼠生殖道感染Ct的保护效果。
结果：
[1]经Lugos碘液染色法进行鉴定，证实Ct培养成功，为建立生殖道感染模型和检测Ct奠定了实验基础；
[2]提取阴道分泌物DNA进行PCR鉴定、阴道分泌物细胞培养计数Ct IFU从而检测Ct清除率和组织病理切片证实106IFU Ct剂量感染小鼠可以建立稳定的小鼠生殖道感染模型；
[3] ELISA结果显示pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/Ct MOMP168免疫组能刺激机体产生抗Ct全菌体的特异性IgG和sIgA；攻击前后比较(第6周进行Ct攻击，取第5周和第7周作为攻击前后对比)：经Ct攻击后1周就能够有效诱发再次免疫应答，血清IgG抗体(A490读数)均值分别为：0.669±0.058和0.951±0.038(T=2.77，p=0.008)。阴道分泌物sIgA第5周、7周比较：0.0401±0.045和0.542±0.040(T=2.17，p=0.001)。Prime-boost免疫策略组IgG抗体均值第5周、7周分别为：0.852±0.058和1.231±0.032(T=2.78，p=0.001)。Prime-boost免疫策略组与pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/Ct MOMP168组有显著性差异(T=2.77，p=0.04)。sIgA第5周、7周分别为：0.523±0.027和0.781±0.052(T=2.78，p=0.001)Prime-boost免疫策略组与pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/Ct MOMP168组有显著性差异(T=2.77，p=0.001)。CTL细胞活性检测结果显示pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/Ct MOMP168组免疫后能产生对靶细胞的特异性杀伤活性均值为46.40％，与对照组比较具有显著性差异(p<0.05)。流式细胞术(FCM)检测脾细胞胞内细胞因子结果显示，免疫后小鼠脾淋巴细胞能够产生较高的IFN-γ，而IL-4和IL-10升高不明显，具有显著性差异(p<0.05)。小鼠外生殖道外观显示疫苗组炎症明显减轻，生殖道Ct清除率明显升高。以上结果提示，pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/CtMOMP168重组疫苗以及利用Prime-boost免疫策略对小鼠Ct生殖道感染具有一定的免疫保护效果。
结论：
[1]成功培养并纯化了Ct；
[2]建立了稳定的小鼠Ct生殖道感染模型；
[3]证实了pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/Ct MOMP168核酸疫苗组和Prime-boost策略组均可针对小鼠生殖道Ct感染产生一定的免疫保护效应。