论文部分内容阅读
肠道病毒7l型(EV71)是导致手足口病的主要病原体之一,常引起多种与神经系统相关的严重疾病。vp1是EV71病毒主要的抗原基因,其编码的外衣壳蛋白在感染宿主细胞时起重要作用。因此,我们选择vp1作为研制EV71疫苗的目标基因。LTB有很强的免疫原性和佐剂活性且无毒。本研究中选用LTB作为分子内粘膜免疫佐剂。双歧杆菌正常存在于人类肠道内,是一种重要的有益的生菌,对人体肠道微环境有重要的调节功能,对婴幼儿肠道有独特的保护作用。双歧杆菌是人类肠道的自然宿主且可以粘附于肠道上皮细胞。因此,本研究的目的是将双歧杆菌发展成一个表达EV71 VP1蛋白和ETEC LTB蛋白的双价口服活疫苗的抗原表达系统。目的构建携带EV71病毒vp1基因和ltb基因的融合表达载体并在大肠杆菌和双歧杆菌中进行表达,鉴定其抗原性和免疫原性。为制备预防EV71感染的口服疫苗奠定基础。方法用重叠延伸PCR(overlap extension PCR)法获得人肠道病毒71型vp1片段与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(ltb)的融合基因。设计14对引物通过重叠延伸PCR技术合成vp1基因,以ETEC(44815)质粒DNA为模板,PCR扩增ltb基因,将vp1基因与ltb基因连接并测序,连接产物插入原核表达质粒pBEX,构建重组质粒pBEX-VP1-LTB,转化E.coli B1221(DE3)进行表达,SDS-PAGE及Western blotting分析其表达。将表达VP1-LTB的大肠杆菌超声破碎后离心提取包涵体制备抗原,经口灌喂免疫小鼠,检测小鼠血清中抗VP1的IgG、IgA,粪便sIgA和肠粘液sIgA,鉴定其免疫原性。电转化法将重组质粒pBEX-VP1-LTB转入双歧杆菌,Western-blot分析其抗原性。口服免疫SD大鼠,采集血清和粪便样品,ELISA检测机体特异的血清IgG和肠道IgA抗体。结果合成的vp1基因全长891bp,测序结果与预期相符,重组表达质粒pBEX-VP1-LTB经PCR及双酶切鉴定,表明构建正确;目的蛋白在E.coli BL21(DE3)中获得了表达,Western-blot分析结果表明该蛋白具有与EV71 VP1抗体结合的抗原性,免疫后小鼠血清抗VP1的IgG、IgA以及粪便sIgA和肠粘液sIgA明显高于PBS和GST对照组。电转法成功将重组质粒转入双歧杆菌, Western-blot分析结果表明该蛋白具有与EV71病毒抗体结合的抗原性。ELISA检测表明重组双歧杆菌免疫后的SD大鼠体内产生了特性的IgG和IgA抗体。结论应用重叠延伸PCR技术成功构建了EV71 VP1-LTB融合表达质粒,并在E.coli BL21(DE3)和双歧杆菌中获得有生物学功能的VP1表达产物,该蛋白具有良好的抗原性和免疫原性,为研制EV71分子内佐剂疫苗打下了基础。该研究表明重组载体pBEX-VP1-LTB可以在双歧杆菌中表达。该重组VP1-LTB基因工程双歧杆菌可诱发SD大鼠特异的粘膜免疫反应,为进一步研制基于双歧杆菌表达系统的手足口病EV71重组亚单位口服活疫苗奠定了基础。