论文部分内容阅读
以己烯雌酚(DES)为研究对象,合成了半抗原己烯雌酚-单-羧基甲基-醚(DES-MCME)和己烯雌酚-单-羧基丙基-醚( DES-MCPE),采用活性酯法和混合酸酐法将DES-MCME和DES-MCPE分别与牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)共价偶联,制备了人工抗原DES-MCME-BSA和DES-MCPE-BSA,包被原DES-MCME-OVA(包被原Ⅰ)和DES-MCPE-OVA(包被原Ⅱ)。根据紫外扫描图谱确定是否偶联成功并计算结合比,考察了反应物不同的摩尔比对最终偶联物结合比的影响。结果表明,当采用活性酯法偶联时,半抗原与BSA反应的投料摩尔比应在50:1左右为宜,生成的偶联物的结合比为10~30:1。分别以DES-MCME-BSA和DES-MCPE-BSA免疫新西兰白兔制备抗血清。双向琼脂扩散法测定抗血清效价大于32:1后采集全血,离心分离血清,并以硫酸铵分步盐析分离抗血清中的抗体,冷冻干燥后-20℃保存。以DES-MCME-BSA为免疫原制备的抗体Ⅰ对己烯雌酚无亲和力,而以DES-MCPE-BSA为免疫原制备的抗体Ⅱ对己烯雌酚具有特异性亲和力。以包被原Ⅱ进行固相包被,成功建立了己烯雌酚间接竞争酶联免疫吸附分析法。方阵实验确定了包被原Ⅱ的最佳包被浓度为1.5μg/ml,抗体Ⅱ的最佳工作浓度为1.5μg/ml。进一步研究了pH值、离子强度和有机溶剂含量对包被原Ⅱ和抗体Ⅱ的亲和作用的影响以及己烯雌酚对包被原Ⅱ和抗体Ⅱ反应抑制率的影响。结果表明:较低pH的反应介质有利于抗原抗体结合,pH6.6最佳。盐浓度对抗原抗体结合反应影响较小,NaCl浓度等于0.15mol/L时最有利于竞争抑制反应,随着盐浓度的增高,抗原与抗体的结合率缓慢下降。低浓度的甲醇有利于包被原Ⅱ和抗体Ⅱ的结合反应,甲醇含量大于15%时抑制包被原Ⅱ和抗体Ⅱ的结合,随着甲醇含量的增加,DES与抗体的亲和力呈明显的下降趋势。在优化条件下,建立了己烯雌酚对包被原Ⅱ和抗体Ⅱ结合反应的间接竞争ELISA标准抑制曲线,回归方程为I=21.00LogC+47.44,r=0.9953,相对标准偏差RSD%=8.54%(n=5)。IC50=1.32ng/ml , IC20=0.05ng/ml。在相同条件下,结构类似物双酚A(BPA)对包被原Ⅱ和抗体Ⅱ结合反应的抑制曲线方程为I=18.84LogC+31.214,r=0.9871。IC50=9.93μg/ml,抗体Ⅱ与双酚A的交叉反应率为0.013%。