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原发性肝细胞癌(肝癌)是亚、非洲最为常见的恶性肿瘤之一,年平均新发病人数约为30万,在我国因原发性肝癌死亡的病例已占恶性肿瘤死亡率的第二位。近年来由于诊疗技术的提高肝癌的生存率已有所改善,手术切除是病人获得长期生存最有效的途径,但即使是根治性切除,其术后5年的复发率仍高达50%-60%,因此降低肝癌术后复发和转移率是进一步提高肝癌治疗疗效的研究热点和难点之一。我们在前期的研究中发现干扰素?有一个新的抗肝癌现象,主要表现为干扰素?对肝癌细胞本身的增殖无明显影响而主要是抑制移植瘤肿瘤血管的形成。 同时我们在临床上也尝试用大剂量﹑长疗程干扰素(治疗术后肝癌患者,以降低肝癌的复发与转移。本课题中应用我所建立的MHCC97细胞模型进一步探讨干扰素(抗人MHCC97肝癌移植瘤的分子机理,为干扰素(临床用于抗肝癌术后复发和转移治疗的病例选择和疗效预测提供帮助。第一部分:干扰素(作用于MHCC97细胞前后差异表达基因的研究一、 差异表达基因谱的检测: MHCC97细胞是从我所首次建立的原位移植人肝癌高转移模型LCI-D20上分离、克隆获得的﹑并能在体外培养体系中长期生长和传代的一株高转移肝癌细胞株。该细胞株不仅保持了原发<WP=5>性肝细胞癌的某些特性如表达HBVsAg和分泌AFP,并且在裸鼠体内显示100%的移植生长和转移,是一株可供人肝癌复发与转移实验性干预研究的、理想的体外细胞模型。本课题首先应用高通量cDNA microarray 技术检测了在3,000 IU/ml干扰素(作用前后MHCC97细胞基因表达谱的改变。结果发现:在受检的8464条人类已知基因中,共发现211条基因的表达受干扰素(调节, 其中有165条基因的转录活性受干扰素(的作用而发生下调,另46条基因的转录活性受干扰素(的作用而发生上调。这些差异表达基因按功能可大致分为以下九类:1)编码与细胞物质和能量代谢相关蛋白和酶的基因;2)编码与细胞增殖、分化及凋亡等功能相关蛋白的基因; 3)编码与细胞形态发生、粘附、运动和细胞骨架重塑相关蛋白的基因; 4)编码与细胞信号传导分子及其相关调节蛋白的基因; 5)编码与血管形成相关蛋白的基因; 6)编码转录因子蛋白的基因; 7)编码与mRNA、蛋白加工、分泌及蛋白降解功能相关蛋白的基因; 8)编码与抗原加工、生长因子和抗病毒相关蛋白的基因;9)目前功能尚未知蛋白的编码基因;表明干扰素(对MHCC97细胞的作用是多方面的。二、 差异表达基因的验证: 选择10条差异表达基因,用半定量RT-PCR和Northern Blot 技术对cDNA microarray的检测结果进行验证。 在被选的10条基因中验证符合率为8/10(80%),其中有一条基因---ERK activator kinase (MEK2) 的表达在cDNA microarray检测中表现为下调,而在半定量RT-PCR和Northern Blot检测中无明显变化,另一条基因---phosphatidylinosital 4,5 bisphosphate 5-phosphatase在cDNA microarray检测中表现为下调,在半定量RT-PCR检测中表现为上调,而在Northern Blot<WP=6>检测中没有变化。上述两条基因在三种检测方法中不同表达的确切原因目前尚不清楚,可能与该两条基因在MHCC97细胞中的低丰度表达有关。绝大多数受检基因的半定量RT-PCR和Northern Blot结果与cDNA microarray的检测结果有相同的上升或下降趋势,表明cDNA microarray技术是一种了解细胞基因表达改变的较好的筛选方法,为进一步研究提供了丰富的信息。第二部分:MHCC97细胞抵抗干扰素(增殖抑制作用的分子机理研究干扰素(是一个多生物学效应的细胞因子,在发挥不同生物学功能时,往往同时启动一条或多条细胞内信号传导通路。从第一部分的cDNA microarray结果表明:干扰素(能调控MHCC97细胞中多条信号传导通路如MAP kinase 、cAMP/PI3 kinase和 TGF(/hMad等信号传导分子编码基因的表达,惟独不影响 Jak/Stats信号传导通路上蛋白分子编码基因的表达。在以往文献报道中,我们发现Jak/Stats信号传导通路是介导干扰素(抗肿瘤细胞增殖作用中至关重要的一条信号传导通路。因此我们将MHCC97细胞抵抗干扰素(增殖抑制效应分子机理的研究主要集中在对该细胞Jak/Stats传导通路完整性的调查上。细胞生长实验结果表明在体外3,000 IU/ml—10,000 IU/ml干扰素(均对MHCC97细胞的生长无显著影响。 半定量RT-PCR和Western Blot结果显示MHCC97细胞结构性转录一定量的I型干扰素受体、p48(ISGF(, IRF9)、stat1和stat2等基因的 mRNA,并表达一定量的Stat1和Stat2蛋白, 但不表达或检测不到P48蛋白和ISGF3的形成,且上述Jak/Stats信号传导分子编码基因的转录和蛋白表达<WP=7>水平均不受干扰素(的调节。核苷酸测序分析发现MHCC97细胞p48基因的多个碱基存在着点突变和插入突变。 用含全长p48 cDNA的表达质粒瞬时转染MHCC97细胞,使其表达P48蛋白,发现转染细胞恢复了对1,000 IU/ml --3, 000 IU/ml干扰素(增殖抑制的敏感性,DNA倍体分析表明干扰素(能抑制质粒转染细胞从S期到G2/M期的过渡,且这种抑制作用可能通过下调细胞周期调控蛋白cyclin A和CDK2的表达实现的。 结果表明MHCC97细胞Jak/Stats信号传导通路的缺陷可能是导致该细胞对干扰素(增殖抑制作用无应答的的主要原因之一。第三部分:干扰素(抑制MHCC97裸鼠移植瘤血管形成的分?