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研究背景：在ICU患者中脓毒症为主要死亡原因之一,总体死亡率大约为30%-40%,而在老年患者或者伴随有其他基础疾病的患者中死亡率超过70%。根据新的流行病学调查,在美国统计重症脓毒症的发病率大约为千分之三,大约一半发生在ICU病房以外,40%的脓毒症病人死于医院,脓毒症休克死亡率最高,可达到50%。国内外相关学者在脓毒症发病机制方面也开展了大量的基础实验和临床试验研究,但是至今仍没有达到一个共识结论。传统认为过度的炎症细胞和介质激活是脓毒症导致脏器损伤的主要原因,但是近期国内外相关学者却发现HMGB1蛋白是脓毒症的晚期介质,其中在大部分脓毒症患者中会升高。HMGB1由激活的免疫细胞合成,可与TLR-2、TLR-4发生关联,从而启动与LPS类似的炎症反应。HMGB1还会引起凝血因子和中性粒细胞的聚集,与促炎细胞因子IL-1等相比,LPS刺激HMGB1的释放发生于相对较晚的阶段。尽管HMGB1在严重脓毒症患者中升高,但是其对脓毒症的预后并没有预测意义。向实验小鼠注射HMGB1是致命的,而用HMGB1抗体对内毒素和盲肠结扎穿孔小鼠具有一定治疗作用,因此推断HMBG1可能是脓毒症治疗的新靶点。中药银杏叶提取物(extract of Ginkgobiloba, EGb761)是从银杏叶中提取的天然活性物质,其中主要有效成分为黄酮糖苷类(24%)和菇烯内醋类(6%),EGb761也是一类纯天然抗氧化剂,调节多种抗氧化酶活性,具有抗炎、抗癌、抗衰老、抑制血小板聚集等多种药理活性。也有研究表明EGb761对早期炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的有一定的抑制作用,国外有文献报道EGb761能够减轻LPS诱导的急性肺损伤,但目前国内外尚未有EGb761对HMGB1蛋白影响的研究。目的：本实验通过体外培养THP-1细胞,观察银杏叶提取物EGb761对LPS诱导THP-1细胞释放HMGB1蛋白表达的调节。为进一步实验及以后临床运用提供可行的依据。材料与方法：1.实验细胞及分组1.1 THP-1细胞的培养将分离的细胞收入离心管中,1000r/min,离心10min弃上清,用含20% FBS的RPMI 1640培养液混匀细胞,调整细胞密度至(110-115)×106/cm2,种入培养皿1,在37℃,5%条件下C02培养；次日换液,以后根据细胞生长情况每2-3日换液1次。1.2将生长良好的THP-1随机分为5组(n=3)。(1)炎性因子检测组：THP-1+EGb761 (50μg/ml)+LPS(1μg/ml)(2)NF-κB的活化检测组；THP-1+EGb761(50μg/ml)+LPS(1μg/ml)(3)不同时间点HMGB1蛋白检测组：THP-1+LPS(1μg/ml)(4)不同浓度EGb761对HMGB1影响检测组：THP-1+EGb761(50κg/ml、100 μg/ml、150μg/ml)+LPS(1μg/ml)(5)HMGB1核转位组THP-1+EGb761(50μg/ml)+LPS(1μg/ml)2.观察指标2.1 ELISA检测炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达将稀释均匀的THP-1细胞培养于24孔板中,每孔加入细胞悬浮液lml及浓度50μg/ml EGb761预处理2h后,用浓度为1μg/ml LPS诱导(均设3个重复孔)6h和12h,吸取培养上清液,按ELISA试剂盒说明书操作。用酶标仪于450 nm波长下检测IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。2.2 Western blotting检测NF-κB的活化将稀释均匀的THP-1细胞培养于24孔板中每孔加入细胞悬浮液lml及浓度50μg/ml EGb761预处理2h后用浓度为1λg/mL LPS诱导(均设3个重复孔)4h、6h和12h后,裂解离心提取上清液并提取蛋白,在4℃一抗孵育过夜,辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG(1：5000稀释)孵育,采用化学发光显色法,以目的条带和P-actin条带积分光密度值的比值(IOD值)定为目的蛋白的相对表达量。2.3 Western blotting检测不同时间点HMGB1蛋白的表达将稀释均匀的THP-1细胞培养于24孔板中每孔加入细胞悬浮液lml及浓度为1μg/ml LPS诱导(均设3个重复孔)6h、12h、18h后,收集细胞上清液裂解离心提取蛋白,在4℃一抗孵育过夜,辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG(1：5000稀释)孵育,采用化学发光显色法,以目的条带和β-actin条带积分光密度值的比值(IOD值)定为目的蛋白的相对表达量。2.4 Western blotting检测不同浓度EGb761对HMGB1表达影响将稀释均匀的THP-1细胞培养于24孔板中每孔加入细胞悬浮液1m1,按浓度50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml的EGb761分为三组预处理2 h,用浓度为1μg/mlLPS诱导(均设3个重复孔)18h后裂解离心提取蛋白,在4℃一抗孵育过夜,辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG(1：5000稀释)孵育,采用化学发光显色法,以目的条带和β-actin条带积分光密度值的比值(IOD值)定为目的蛋白的相对表达量。2.5共聚焦荧光显微镜观察HMGB1蛋白的核转位将稀释均匀的THP-1细胞培养于24孔板中每孔加入细胞悬浮液1ml和浓度150μg/mlEGb761预处理2h后用浓度为1μg/ml LPS诱导(均设3个重复孔)18 h,采用共聚焦显微镜荧光法标记,HMGB1蛋白用绿色荧光标记,细胞核用蓝色荧光标记为对照,将两者重叠后在荧光显微镜下观察HMGB1在细胞内分布变化。3.统计学处理各组数据采用均数±标准差(mean±SD)表示并应用统计学软件SPSS 13.0进行处理。采用单因素方差分析不同组别间的比较,以(P<0.05)为差异有统计学意义。结果1.ELISA检测炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达ELISA检测结果表明,LPS诱导THP-1细胞6-12h后,可分泌大量的IL-1p、IL-6、TNF-α炎性因子较空白对照组高(P<0.05)。培养液中IL-1β、IL-6、TNF-α浓度明显增加,经过EGB761干预后,THP-1细胞培养液中IL-1β、IL-6、TNF-α浓度较LPS组明显降低有显著的差异(P<0.05)。2.EGb761对不同时间点NF-κB舌化检测Western blotting检测THP-1细胞经LPS诱导后,NF-κB表达增高,经过EGB761干预2-12h,THP-1细胞培养液中NF-κB含量随着EGb761干预时间延长较空白对照组呈明显下降趋势(P<0.05)有统计学意义。3.LPS诱导THP-1细胞不同时间段释放HMGB1蛋白表达变化Western blotting检测结果显示：LPS诱导THP-1细胞12h后,细胞上清液中HMGB1蛋白含量较空白组升高,并随着时间延长18h HMGB1蛋白含量呈明显升高趋势(P<0.05)有统计学意义。4.不同浓度的EGb761对LPS诱导THP-1细胞产生HMGB1蛋白表达的变化Westernblottting检测结果显示：EGb761干预LPS诱导THP-1细胞18h后上清液中HMGB1蛋白含量较空白对照组低,HMGB1蛋白含量随着EGB761浓度增加至150μg/ml呈下降趋势并呈剂量依赖效应(P<0.05)有统计学意义。5.EGb761抑制LPS诱导THP-1细胞释放HMGB1蛋白核转位在共聚焦显微镜下显示：空白组HMGB1乎全部分布在核内；LPS诱导组可见HMGB1大部分从细胞核转移到胞浆中；EGb761和LPS干预组均可见部分HMGB1分布。结论1.LPS可诱导THP-1细胞IL-1β、IL-6、TNF-α表达增多及NF-κB活化,导致HMGB1蛋白表达增多及核转位。2.EGB761能抑制THP-1细胞IL-1β、IL-6、TNF-α表达及NF-κB活化,调节HMGB1蛋白的表达及核转位。