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新城疫(Newcastle disease,ND)是危害养禽业最严重的急性传染病之一,该病病原新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)属于副粘病毒科腮腺炎病毒属,是一种有囊膜的负链RNA病毒,在其囊膜上有两种重要的功能蛋白纤突,即融合蛋白(F)和血凝素—神经氨酸酶(HN),它们是NDV的致病基础和主要宿主保护性抗原,也是与细胞融合密切相关的两个糖蛋白。既表达黏附蛋白又表达F蛋白的感染细胞能够融合邻近的细胞形成多核细胞或称核胞体,HN蛋白和F蛋白对于细胞融合来说都是必需的。 由于这两种蛋白分子量较大不易表达,且其免疫原性主要决定于抗原表位,故本研究分析了HN蛋白的抗原结构,构建了HN蛋白结构域基因片段原核和真核表达重组质粒,并利用本实验室已经构建好的F蛋白结构域基因片段真核重组表达质粒,进行了HN和F蛋白共表达对细胞融合影响的实验研究。 我们用PCR方法获得了NDV HN蛋白结构域基因HNa和HNb,并通过重叠一延伸PCR对二者进行重组,获得了HNa-L-b片段。将三种基因片段插入原核表达载体pET32c,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导后获得了表达,Westernblotting分析证实表达产物HNa和HNb与NDV阳性血清具有免疫反应性。根据western blotting结果,将含HNa和HNb重组质粒的重组菌大量表达,并通过镍琼脂糖凝胶纯化,免疫家兔,制备了抗HNa和抗HNb的多抗。 将HN蛋白结构域基因片段HNa、HNb和HNa-L-b插入真核表达载体pcDNA3的CMV启动子下游,构建重组真核质粒pcDNA3-HNa、pcDNA3-HNb。将这两种质粒和实验室保存的重组质粒pcDNA3-HN、pcDNA3-F和pcDNA3-Fa(c)脂质体介导转染HeLa细胞,分别用新城疫阳性血清和制备的多抗检测,用FITC标记的特异性二抗进行间接免疫荧光试验,均可以观察到特异性黄绿色荧光,说明重组质粒能够在HeLa细胞中表达具有免疫反应性的目的蛋白。 将F全长、Fa(c)片段真核表达重组质粒分别与HN全长、HNa和HNb片段真核表达重组质粒在脂质体介导下逐一共转染HeLa细胞。转染后24h,Fa(c)片段与HNa、HNb共转染孔就观察到了细胞融合,36h后每个共转染孔都观察到了细胞融合,同时用间接免疫荧光的方法也检测到了细胞融合,即合胞体。单独转