背景:细胞程序性坏死是近年来鉴定的一种新的细胞程序性死亡方式,因细胞死亡时表现出典型的细胞坏死特征,如细胞内出现空泡,细胞器变形或肿大,细胞膜破裂等,故被命名为细胞程序性坏死,也叫坏死样凋亡。细胞程序性坏死参与了多种重要的生理与病理过程,如胚胎发育、缺血再灌注损伤、炎症反应及外源微生物入侵(细菌与病毒)导致的机体感染等。因此,鉴定细胞程序性坏死的调控靶点及其调控机制,将进一步揭示细胞程序性坏死的调控机理,并为细胞程序性坏死相关疾病的药物设计和临床治疗提供新的靶标。多种因素都能诱导细胞程序性坏死,但目前研究最为透彻的是TNFα诱导的细胞程序性坏死,其信号转导通路已经被同行研究者广泛认同。在TNFα诱导的细胞程序性坏死过程中,其首先与细胞膜上的受体TNFR1结合,促使TNFR1的胞内结构域构象发生改变,进而招募并结合RIP1和TRADD等多种蛋白,在细胞膜上形成蛋白复合体I。复合体I中的RIP1在E3泛素连接酶c IAP1的作用下发生泛素化修饰,进而结合TAB和TAK1,活化IKK及后续的NF-κB信号通路。RIP1在去泛素化酶CYLD的作用下去除泛素化,从复合物Ⅰ上解离并进入细胞质,与细胞质中的TRADD及FADD等蛋白结合形成复合体II。FADD可以招募并结合caspase8,进而促进caspase 8的剪切及caspase信号通路的活化,诱导细胞凋亡。当利用caspase抑制剂Z-VAD阻断casapse 8活化后,RIP1与细胞内高表达的RIP3通过RHIM结构域结合,形成坏死复合体(necrosome)。坏死复合体中的RIP1或RIP3可以通过RHIM结构域形成同源多聚体,或在活性氧的作用下氧化自身蛋白多肽链中半胱氨酸的二硫键,相互交联形成多聚体。多聚体的形成可以通过自身磷酸化或其它机制促进RIP1与RIP3的磷酸化。RIP3活化后进一步招募并结合下游靶蛋白MLKL,促进MLKL磷酸化及寡聚化,进而转移到细胞膜上并使其破裂,导致细胞程序性坏死的发生。因此,RIP1、RIP3和MLKL是调控细胞程序性坏死的关键靶点,三者组成的RIP1/RIP3/MLKL信号通路在TNFα诱导的细胞程序性坏死过程中发挥着关键性的调控作用。PI3K即磷脂酰肌醇激酶,它既有磷脂酰肌醇激酶活性,也有丝氨酸/苏氨酸激酶活性。PI3K可分为3类,其结构与功能各异。其中,Ⅰ型PI3K目前研究最为广泛,它是由调节亚基p85和催化亚基p110构成的一个异源二聚体。研究表明PI3K在细胞生长、增殖和生存等过程中均发挥着重要作用,它能通过磷脂酰肌醇激酶活性来活化AKT,从而形成PI3K/AKT信号通路,促进细胞的生存与增殖,抑制细胞凋亡,除此之外,它也能直接活化SGK和PKC等蛋白激酶,促进细胞迁移和存活。然而,最近的研究发现PI3K抑制剂能阻断细胞程序性坏死的发生。因此,PI3K可能在细胞程序性坏死中发挥着关键性的作用,是调控细胞程序性坏死的重要靶点,但其具体机制并不清楚。目的:鉴定PI3K在细胞程序性坏死中的调控作用,并明确其具体调控机制,为程序性坏死相关疾病的治疗及药物研发提供新的靶标和指导。方法:利用TNFα单独或与细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK联合处理L929细胞,构建细胞程序性坏死模型,并用流式细胞仪检测细胞死亡率。利用慢病毒介导的RNA干涉技术构建PI3K催化亚基p110α敲低、RIP1敲低及RIP1与p110α双敲低的的L929细胞株,RT-PCR和Western blot检测p110α和RIP1敲低效果。Western blot检测AKT、RIP1、RIP3和MLKL的磷酸化水平及RIP1、RIP3、MLKL多聚体的形成,Duolink实验检测RIP1与RIP3的相互作用,p110α与RIP1及RIP3的相互作用及RIP1和RIP3同源多聚体的形成情况。结果:在第一部分研究中我们重点探索了PI3K在细胞程序性坏死中的靶向调控作用。我们发现在经典的细胞程序性坏死模型TNFα诱导的L929细胞程序性坏死过程中,PI3K抑制剂LY294002和A66都具有显著的保护效果,敲低PI3K的催化亚基p110α也具有同样的效果,表明PI3K的确是调控细胞程序性坏死的靶点。同时我们发现AKT抑制剂也能明显阻断TNFα诱导的细胞程序性坏死,鉴于AKT是PI3K的靶蛋白,因此PI3K可能通过活化AKT信号通路从而介导TNFα单独诱导的L929细胞程序性坏死的发生。然而AKT抑制剂对TNFα与Z-VAD联合诱导的L929细胞程序性坏死并没有保护作用,而p110α敲低则完全阻断TNFα与Z-VAD联合诱导的细胞程序性坏死,表明PI3K可能通过其它机制介导TNFα与Z-VAD联合诱导的细胞程序性坏死。因此,在第二部分研究中我们对PI3K调控细胞程序性坏死的具体机制作了进一步的鉴定。结果显示在TNFα与Z-VAD联合诱导的L929细胞程序性坏死过程中,p110α敲低显著抑制RIP1、RIP3和MLKL的磷酸化,表明p110α敲低阻断了RIP1/RIP3/MLKL信号通路的活化。进一步的研究发现p110α敲低能够抑制RIP1与RIP3结合形成的坏死复合体,同时对RIP1或RIP3同源多聚体的形成也具有明显的抑制作用,表明PI3K可能通过抑制坏死复合体的形成,进而抑制RIP1/RIP3/MLKL信号通路的活化。同时,我们发现p110α敲低能够降低RIP1和RIP3的初始磷酸化水平,而后者是促进RIP1与RIP3结合形成坏死复合体的重要因素,因此,PI3K可能通过调控RIP1和RIP3的初始磷酸化来介导坏死复合体的形成及细胞程序性坏死的发生。此外,我们还检测了p110α与RIP1及RIP3之间的相互作用情况,发现在TNFα与Z-VAD联合诱导细胞程序性坏死过程中,p110α与RIP3之间的相互作用增强,但未检测出p110α与RIP1的结合。鉴于p110α是PI3K的催化亚基,具有丝/苏氨酸蛋白激酶活性,因此,PI3K可能通过结合并磷酸化RIP3来促进细胞程序性坏死的发生。结论:本研究鉴定了PI3K是调控细胞程序性坏死的重要靶点,可以通过活化AKT信号通路,进而介导TNFα诱导的细胞程序性坏死。同时,PI3K能够调控RIP1和RIP3的初始磷酸化,进而促进坏死复合体的形成和RIP1/RIP3/MLKL信号通路的活化,介导TNFα与Z-VAD联合诱导的细胞程序性坏死。