肥胖是女性乳腺癌高危因素之一。研究报道肥胖相关基因—脂肪量和肥胖相关基因(Fat mass and obesity associated gene,FTO)的多个单核苷酸多态性位点与多种肿瘤的患病相关,包括乳腺癌。此外,最近的研究发现FTO是烷烃羟化酶(ALKB)(细菌DNA修复酶)蛋白家族成员之一,其主要的作用底物是6-甲基腺嘌呤(m~6A),是m~6A去甲基化修饰酶;而m~6A的甲基化修饰参与了多种肿瘤的发生、发展。目前,FTO在乳腺癌中的表达情况,尤其是不同乳腺癌分子亚型的表达情况,以及其去甲基化功能对乳腺癌的发生、发展的影响目前尚不清楚。本论文旨在:(1)通过免疫组织化学方法检测乳腺正常上皮组织、乳腺癌原发癌灶及其配对的转移灶中FTO蛋白表达,详细收集临床病理资料及随访数据,分析正常乳腺上皮组织、乳腺癌原发灶及转移灶中FTO基因表达差异及其与各临床参数、生存预后的关系;(2)建立野生型FTO与FTO R96Q错义突变体过表达乳腺癌细胞株,及利用小干扰RNA干扰FTO的表达,分析FTO不同表达水平及去甲基功能变化后对乳腺癌细胞株RNA中m~6A水平变化,及乳腺癌细胞增殖、迁移、凋亡等生物行为的影响,并进一步检测Vimentin、TGF-β1、C-myc等因子变化水平,初步探索其分子机制。第一部分乳腺癌组织中FTO蛋白表达水平与临床病理特征、生存预后的关系目的:分析FTO蛋白在乳腺正常上皮组织、乳腺癌原发癌灶及其相配对的转移灶中的表达情况,探索乳腺正常上皮组织、乳腺癌原发灶及转移灶中FTO蛋白表达差异与临床病理特征、生存预后的关系。方法:1.研究收集2009年1月至2014年6月在广西医科大学附属肿瘤医院初诊的乳腺癌病例108例,其中包括复发病例63例,随访3年无复发病例45例,同时收集乳腺正常上皮组织41例。所有乳腺癌患者均病理确诊证实为浸润性癌,其临床和随访资料完整、原发癌灶及转移癌灶组织蜡块在我院病理科保存。2.用免疫组织化学方法检测乳腺正常上皮组织、乳腺癌原发癌灶及其相配对的转移灶中FTO蛋白的表达情况,分析乳腺正常上皮组织、乳腺癌原发灶及转移灶中FTO基因表达差异与临床病理特征、分子分型及无复发生存之间的关系。结果1.FTO蛋白在乳腺正常上皮组织与乳腺癌组织中均有表达,FTO蛋白在乳腺癌原发灶中的表达水平要显著高于乳腺正常上皮组织,差异具有统计学意义(高表达率:46.5%vs 29.3%,P=0.03)。利用BMI进行分层后,在BMI≥24的患者中,乳腺癌原发灶中FTO蛋白的表达水平要高于乳腺正常上皮组织(高表达率为:51.5%vs 25.0%),差异具有统计学意义(P=0.03);而在BMI﹤24的患者中,FTO蛋白在乳腺癌组织与乳腺正常上皮组织中表达无统计学差异;2.FTO蛋白在luminal型复发乳腺癌表达率为66.6%,显著高于3年未复发的同型乳腺癌患者(高表达率:66.6%vs 33.3%,P=0.006);3.乳腺癌中FTO蛋白的表达水平与患者的年龄、BMI指数、G分级、T分期、N分期、临床分期、以及ER、PR、HER-2、Ki-67表达均无明显相关性(所有P﹥0.05)。4.分析复发患者,原发癌组织中FTO蛋白高表达患者的平均复发时间是1.9年,低FTO表达患者的平均复发时间是2.3年,两组之间无显著性差异;5.FTO蛋白在63例配对乳腺癌原发灶和转移灶中高表达率分别为44.4%和49.2%,两者之间的表达不存在显著差异(P=0.590);但FTO在乳腺癌原发灶和转移灶之间的总变化率为49.2%,分层分析:FTO在luminal B型、HER-2过表达型、base-like型乳腺癌原发灶和转移灶中总变化率分别为:52.5%、50%、50%,不同分子分型中FTO蛋白在原发灶和转移灶的表达未发现有明显差异。结论1.FTO蛋白在乳腺癌组织中表达水平高于乳腺正常上皮组织;2.在Luminal型乳腺癌中,3年内复发患者的FTO蛋白表达水平显著高于无复发患者,提示FTO可能是Luminal型乳腺癌早期复发的预测因子;3.FTO蛋白表达与乳腺癌患者的年龄、BMI指数、G分级、T分期、N分期、临床分期、以及ER、PR、HER-2、Ki-67表达等临床病理特征无明显相关性;4.FTO蛋白乳腺癌原发病灶和对应的转移灶中高表达率相似;但存在较高变化率。第二部分不同FTO表达状况乳腺癌细胞株构建及鉴定目的:在人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231细胞中构建FTO不同表达水平及FTO R96Q错义突变体细胞株,为探索FTO表达状况对乳腺癌细胞生物行为的影响及分子机制奠定基础。方法:构建表达不同FTO表达水平及FTO R96Q错义突变体的慢病毒载体,测序等验证其正确性;并感染人乳腺癌细胞系,用q RT-PCR和Western blot确定FTO在慢病毒载体转染后感染效果。结果:1、构建FTO过表达及FTO R96Q错义突变体质粒,并酶切及测序验证正确;构建FTO sh RNA敲降质粒;2、MDA-MB-231细胞FTO mRNA的相对表达量在野生型FTO过表达质粒、FTO R96Q突变体过表达质粒组分别为7.66±0.398、3.50±0.431,均高于空载质粒组(1.64±0.036)(P均<0.05);而si RNA2转染后MDA-MB-231细胞FTO m RNA的相对表达量为:0.21±0.013,明显低于空载质粒组(P<0.05)。3、对不同质粒转染后MDA-MB-231细胞FTO蛋白表达的变化同FTO m RNA变化是一致的,在野生型FTO过表达质粒组与FTO R96Q突变体过表达质粒组FTO表达量明显升高;而在FTO si RNA干扰组FTO蛋白表达量显著下降。4、MCF-7乳腺癌细胞中不同FTO慢病毒载体转染后,FTO在m RNA及蛋白水平变化不显著。结论:本实验通过慢病毒载体转染技术获得了FTO基因不同表达状况的MDA-MB-231细胞株。该细胞将用于后续研究FTO表达对细胞生物学行为能力的影响。第三部分:FTO基因表达水平及FTO-R96Q错义突变体对乳腺癌细胞生物学行为影响的实验研究目的:分析FTO不同表达水平及失去去甲基化功能对乳腺癌细胞RNA中m~6A含量、细胞增殖、迁移、凋亡等生物行为的影响,并进一步检测Vimentin、TGF-β1等因子水平变化,初步探索其分子机制。方法:1.使用半定量试剂盒检测不同FTO表达水平及去甲基化功能变化后MDA-MB-231细胞RNA中m~6A含量。2.采用MTT法、Transwell小室法检测不同FTO表达水平及去甲基化功能变化后MDA-MB-231细胞株增殖、迁移能力变化;3.采用流式细胞技术分析不同FTO表达水平及去甲基化功能变化后MDA-MB-231细胞株细胞周期、细胞凋亡的改变;4.采用实时荧光定量PCR技术分析Vimentin、TGF-β1、Cycln D1、C-myc等肿瘤迁移、增殖相关分子m RNA水平的变化情况;结果:1.FTO过表达后MDA-MB-231细胞RNA中m~6A的含量下降了15%;干扰FTO表达后MDA-MB-231细胞RNA中m~6A的含量增加了79%;转染FTO R96Q突变质粒后,MDA-MB-231细胞RNA中m~6A含量增加了30%;2.MTT结果表明,野生型FTO过表达细胞株在24、48、72、96小时的吸光度分别为:0.335±0.01、0.60±0.07、0.867±0.147、1.216±0.006与空载质粒组对应时间的吸光度值0.305±0.004、0.452±0.182、0.615±0.015、0.882±0.012相似,FTO si RNA质粒不同时间的吸光度同空载质粒也无明显差别;而FTO R96Q突变体过表达质粒细胞株24、48、72、96小时的吸光度分别为0.542±0.009、0.860±0.01、1.13±0.048、1.238±0.010高于空载质粒组。3.Transwell结果显示:野生型FTO过表达组MDA-MB-231细胞穿膜细胞数为167.4±10.2,明显多于空载质粒组(41.6±6.3)(P<0.01);si RNA干扰组中穿过膜的细胞数为32.5±4.8,略少于空载质粒组的穿膜细胞数,差异无统计学意义;FTO R96Q突变体过表达质粒组的穿板数目为78±7,较空载质粒组增多,却显著少于野生型FTO过表达组。4.细胞周期结果显示:野生型FTO过表达组、FTO R96Q突变体过表达质粒组及si RNA干扰组三组间的MDA-MB-231细胞周期构成无明显差异(P值﹥0.05)。5.细胞凋亡的研究显示:干扰FTO表达后,MDA-MB-231细胞总凋亡率为18.12%,明显高于空载质粒组(7.01%);野生型FTO过表达组细胞凋亡率为3.16%,明显低于空载质粒组;FTO R96Q突变体过表达质粒组细胞凋亡率为12.31%,显著高于空载质粒组,差异有统计学意义。6.肿瘤迁移、增殖相关因子RT-PCR显示,野生型FTO过表达组中Vimentin、TGF-β1 m RNA水平有不同程度的上调,而在转染FTO R96Q错义突变质粒的MDA-MB-231细胞中Vimentin显著下调、TGF-β1 m RNA水平变化不明显。而干扰FTO表达后MDA-MB-231细胞的Vimentin m RNA水平表达下调、TGF-β1 m RNA表达明显上调;对于肿瘤增殖相关因子,野生型FTO过表达组MDA-MB-231细胞Cyclin D1 m RNA水平无明显变化,C-myc有轻度上调,FTO R96Q突变体过表达质粒组中细胞Cyciln D1以及C-myc m RNA水平明显下调,而干扰FTO表达后MDA-MB-231细胞的Cyclin D1 m RNA下调,c-myc m RNA上调。结论:1.在MDA-MB-231细胞中FTO过表达降低了m~6A水平,FTO去甲基化功能丧失后明显增加了m~6A水平;干扰FTO表达后m~6A表达水平也明显升高;2.转染FTO R96Q错义突变质粒后MDA-MB-231细胞增殖能力增强,MDA-MB-231细胞中过表达、干扰FTO表达后细胞增殖能力变化不显著;3.野生型FTO过表达的MDA-MB-231细胞株迁移能力明显增强,FTO R96Q错义突变过表达后的MDA-MB-231细胞高迁移能力明显下降;干扰FTO表达后MDA-MB-231细胞迁移能力明显减弱。4.FTO表达对MDA-MB-231细胞周期无影响;5.干扰FTO表达后MDA-MB-231细胞的凋亡率明显增加,过表达后MDA-MB-231细胞的凋亡率明显降低,转染FTO R96Q错义突变质粒细胞凋亡明显增加;6.FTO基因过表达组MDA-MB-231细胞TGF-β1、Vimentin mRNA表达上调;干扰FTO表达或FTO丧失去甲基化活性Vimentin m RNA下调,提示FTO基因可能通过TGF-β1通路影响细胞的迁移能力,这种作用可能与其去甲基化作用有关。