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在全球范围内,心血管疾病是引起人类死亡的主要原因之一,而在多种类型的心血管疾病中,缺血性心脏疾病是引起死亡的首要原因;目前,再灌注仍旧是针对缺血性心脏疾病最有效的治疗方法。然而,再灌注治疗会导致再灌注损伤;研究表明再灌注过程中心肌组织线粒体内所产生的活性氧类(reactive oxygen species,ROS)会导致线粒体氧化应激,引起线粒体功能紊乱,进而导致心肌组织损伤,然而其中的机制尚未完全阐明。MicroRNAs(miRs)作为一类新型的调节分子,通过与靶基因mRNA的3’非编码区域(untranslated region,UTR)特异性结合,在转录或翻译水平对靶基因表达进行调控。已有研究显示,miRs广泛参与心脏疾病的病理发生过程中。本课题组前期研究表明,雌激素通过抑制miR-22表达进而增加心肌细胞中CSE与H2S表达,最终发挥抗氧化应激效应。进一步的生物信息学分析发现,miR-22可以靶向于Sirt1、PGC1α这两个具有抗线粒体氧化应激功能的基因,然而miR-22是否通过直接调节线粒体功能相关基因的表达而参与心肌氧化应激损伤尚未可知。因此,本研究在整体水平上采用大鼠心肌缺血-再灌注(I/R)模型,细胞水平上采用缺氧-复氧(H/R)模型,拟首先观察miR-22在心肌细胞氧化应激损伤时的表达改变,继而进一步研究miR-22在心肌细胞氧化应激损伤中的作用及其分子机制。主要实验结果如下:一.miR-22上调参与了I/R诱导的心肌损伤1.I/R对心肌组织中mi R-22表达的影响;(1)大鼠心脏横冠状动脉结扎30分钟后复灌2小时,血清中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、缺血区心肌细胞凋亡数量与梗死面积均显著增加,表明I/R模型构建成功;(2)同假手术组相比,I/R组大鼠心脏缺血心肌组织中miR-22表达显著增加;2.miR-22抑制剂对I/R诱导心肌损伤的影响;大鼠进行I/R前48小时给予心肌内注射20ug mi R-22抑制剂或者等量mi R control,与对照组相比,miR-22抑制剂能够显著降低血清中CK、LDH水平,心肌细胞凋亡数量以及梗死面积,并且仅给予心肌内注射miR-22抑制剂对心脏功能无显著影响;二.mir-22上调参与了h/r诱导的心肌细胞损伤1.h/r对心肌细胞中mir-22表达的影响;(1)心肌细胞进行缺氧24小时,氧分压1%,复氧2小时后心肌细胞的活力受到显著抑制,细胞ldh释放量以及凋亡细胞数量均显著增加,表明h/r模型构建成功;(2)同对照组相比,h/r组心肌细胞中mir-22表达显著增加;(3)同对照组相比,h/r组p53及其靶基因p21蛋白表达显著增加,而nac能够显著逆转这一效应,并且h/r增加心肌细胞内mir-22表达能够被nac与p53抑制剂逆转;2.mir-22模拟物与mir-22抑制剂对h/r诱导的心肌细胞损伤的影响;心肌细胞h/r处理前24小时转染200nm的mir-22模拟物或者mir-22抑制剂,过表达心肌细胞中mir-22不仅能够诱导细胞损伤,即显著增加心肌细胞ldh的释放量、凋亡数量,抑制细胞活力,并且可进一步加重h/r所引起的细胞损伤作用,然而h/r的细胞损伤效应能够被mir-22抑制剂所逆转,并且mir-22抑制剂表现出一定的细胞保护作用,即降低细胞ldh的释放量与凋亡数量,增强细胞活力。三.mir-22上调参与了i/r损伤诱导的心肌组织线粒体功能紊乱同心肌内给予mircontrol后行i/r组相比,心肌内给予mir-22抑制剂后行i/r组心肌组织线粒体超氧阴离子生成量显著下降,线粒体内atp生成量与线粒体膜电位显著升高,与此同时,心肌内仅给予mir-22抑制剂而不进行i/r对心肌组织线粒体功能没有明显影响。四.mir-22上调参与了h/r损伤诱导的心肌细胞线粒体功能紊乱mir-22不仅能够诱导心肌细胞线粒体功能紊乱即增加线粒体内超氧阴离子生成量,降低线粒体内atp生成量与线粒体膜电位,同时能够进一步加重h/r损伤所致的线粒体功能障碍,然而h/r的损伤效应能够被mir-22抑制剂所逆转,并表现出一定的线粒体保护作用,即降低线粒体内超氧阴离子生成量,增加线粒体内atp生成量与线粒体膜电位。五.sirt1与pgc1α是mir-22在心肌细胞中靶基因应用生物信息学分析发现mir-22可以靶向于线粒体功能相关基因sirt1与pgc1α,荧光素酶报告基因及qpcr、westernblot明确了mir-22可直接抑制sirt1、pgc1α的转录活性及mrna、蛋白质水平的表达。六.Sirt1 siRNA以敲低Sirt1基因表达可逆转miR-22抑制剂的保护性作用1.Sirt1 siRNA与miR-22抑制剂对心肌细胞中Sirt1与PGC1α蛋白水平表达的影响H/R能够抑制心肌细胞中Sirt1与PGC1α蛋白水平表达,而miR-22抑制剂不仅能够增加心肌细胞中Sirt1与PGC1α蛋白水平表达,同时能够逆转H/R对Sirt1与PGC1α蛋白水平表达抑制效应;Sirt1 siRNA不仅能够进一步加重H/R的抑制效应,并且能够阻断mi R-22抑制剂对心肌细胞中Sirt1与PGC1α蛋白水平表达的影响。2.Sirt1 siRNA与miR-22抑制剂对心肌细胞线粒体功能的影响Sirt1 si RNA能够阻断miR-22抑制剂的心肌细胞线粒体保护作用,即增加线粒体内超氧阴离子生成量,降低线粒体内ATP生成量与线粒体膜电位。3.Sirt1 si RNA与miR-22抑制剂对心肌细胞能的影响Sirt1 si RNA能够阻断miR-22抑制剂的心肌细胞保护作用,即增加心肌细胞LDH的释放量与细胞凋亡数量,抑制心肌细胞活力。结论:心肌缺血-再灌注增加心肌组织miR-22表达,进而通过ROS所诱导的p53/p21通路激活,进一步靶向线粒体相关基因Sirt1、PGC1α,导致心肌细胞线粒体氧化应激,进一步诱导心肌组织损伤。