白血病是造血组织的肿瘤疾病,其特征为白血病细胞在骨髓及其它造血组织中呈恶性、无限制地增生,浸润全身各组织和脏器,使正常造血受抑制。在我国,白血病是常见的恶性肿瘤之一,死亡率大约为2.52/10万。　　 根据增生细胞类型,白血病可分为粒细胞性、淋巴细胞性和单核细胞性三类。按白血病细胞分化程度可分为急性及慢性两大类。其中慢性粒细胞性白血病(Chronic myelogenous leukemia,CML),居我国慢性白血病发病率之首。　　 CML是一种发生在骨髓早期多能造血干细胞上的恶性增生性疾病(获得性造血干细胞恶性克隆性疾病)。其主要特征为未成熟分化的早幼粒细胞在骨髓中呈恶性、无限制地增生,并在血液中大量累积。根据临床进展,CML的病程可分为慢性期(chronic phase,CP),加速期(accelerated phase,AP)和急变期(blastcrisis,BC)。该病进展缓慢,但多数慢性期患者病情可逐步演变,可经过加速期或直接进入急变期。一旦发生急性变,患者的存活期仅有3～6个月。　　 CML的发生与费城染色体易位有着很深的联系。费城染色体易位使9号染色体长臂(9q34)上的原癌基因ABL(c-ABL)移位至22号染色体(22q11)上的BCR(Break point cluster region)断裂点上,重新组合成BCR-ABL基因。90％以上的CML中存在Ph染色体。融合基因编码的融合蛋白P210,具有异常增强的酪氨酸激酶的活性,导致CML的发生。　　 P210蛋白能与白细胞介素3受体β(interleukin-3 receptor beta)亚基相互作用,通过级联放大的活化作用激活一系列控制细胞周期的蛋白质,从而加快细胞分裂。此外,P210蛋白还抑制DNA修复,影响基因组的稳定,使其更易产生遗传突变。因此,P210蛋白所具有的增强型酪氨酸激酶活性被普遍认为是引起CML的主要因为。　　 microRNAs(miRNA)是一类真核生物中普遍存在的长度约为18～25个核苷酸的单链RNA分子,通过与靶mRNA3’端非编码区(3’UTR)互补结合在转录后水平抑制靶基因的表达。人类基因组编码约一千余种miRNA,它们能够靶向作用于哺乳动物基因组中至少30％的编码基因。miRNA既可作为抑癌基因,下调原癌基因的活性；也可作为癌基因,下调抑癌基因的活性。不同的细胞类型中,同样的miRNA可能作为癌基因或抑癌基因,而且在某类型的细胞中任何一个miRNA的靶基因一般不会只有一个,而每一个靶基因又可能和多个miRNA相互作用,因组成了错综复杂的调控网络,在转录后对各种基因进行复杂的调控,参与肿瘤的发生发展。　　 本课研究通过生物信息学分析寻找能对BCR-ABL基因进行靶向调控的miRNA分子,并进行初步的实验验证。研究内容主要有以下几部分:　　 第一部分:应用TargetScan5.1生物信息学软件进行预测并得出可能与ABL的mRNA 3’UTR互补结合的miRNA。分析结果显示Hsa-miR-196b可能通过与BCR-ABL mRNA 3’UTR部分结合而抑制其翻译表达。结合检索文献的结果,选择了Hsa-miR-196b,对其在CML中的功能进行研究。　　 第二部分:针对Hsa-miR-196b的初始转录产物pri-Hsa-miR-196b(包括前体pre-Hsa-miR-196b及其3’、5’端各约200bp侧翼序列)设计合成引物。从正常人外周血中提取基因组DNA作为模板,通过PCR扩增获得目的基因片段。通过Hpa Ⅰ/Xho Ⅰ双酶切及T4连接酶连接将其插入Lentilox 3.7(pLL-3.7)质粒中。通过质粒PCR及双酶切筛选并鉴定出阳性重组质粒,DNA测序鉴定其序列的保真性。　　 实验结果表明,成功克隆pri-Hsa-miR-196b,并将其正确地插入到pLL-3.7质粒的克隆位点中,获得pLL-3.7-196b表达载体。　　 第三部分:将成功构建的pLL-3.7-196b表达载体与慢病毒包装质粒pCMV-dR8.91、包膜蛋白质粒pCMV-VSV-G共转染至HEK293FT细胞中,以包装能表达Hsa-miR-196b的缺陷性慢病毒颗粒。转染72h后,收集含病毒颗粒的细胞培养基,离心后过滤,获得病毒上清。将病毒上清梯度稀释后感染HEK293FT细胞,以表达GFP绿色荧光蛋白的细胞数来计算病毒滴度。应用SYBR Green Ⅰ实时定量PCR法检测慢病毒载体感染后HEK293FT细胞中Hsa-miR-196b的表达情况,3％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的长度。　　 病毒滴度检测结果为7.3±1.1×107TU/mL,具有较高的感染效率,可用于下一步的研究。实时定量PCR结果表明,与未感染的细胞相比,受慢病毒载体感染的HEK293FT细胞中Hsa-miR-196b的表达量提高了近22倍。溶解曲线分析和琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR扩增特异,扩增产物的片段长度与预期的一致,说明该表达载体能在细胞内表达出成熟的Hsa-miR-196b。　　 第四部分:以K562细胞为模型,用Hsa-miR-196b慢病毒载体对其进行感染,同时设阴性对照组与空白对照组。感染后12h,离心去上清,换入新培养基继续培养。感染后96h裂解细胞,提取总RNA与总蛋白。利用实时定量PCR检测Hsa-miR-196b的表达变化,western blot检测P210蛋白表达变化,根据其结果评价Hsa-miR-196b过表达对P210蛋白表达的影响。　　 实验结果说明Hsa-miR-196b能抑制BCR-ABL基因的表达,但不能说明这种抑制作用是由于直接的靶向调控所导致的,还是由于Hsa-miR-196b靶向抑制调节了其它基因而影响到BCR-ABL基因的表达。因此,还需要更多、更深入的实验来验证和研究Hsa-miR-196b对BCR-ABL基因的调节作用。　　 本课题运用生物信息学分析筛选出潜在的能对CML致病基因BCR-ABL进行靶向调控的miRNA分子。运用PCR成功克隆其基因片段,构建得到pLL-3.7-miR-196b重组表达载体。通过病毒包装获得能高效感染哺乳动物细胞,持续、稳定表达Hsa-miR-196b的慢病毒表达载体。应用该慢病毒载体感染BCR-ABL基因阳性的K562细胞,并对感染结果进行检测,初步验证了Hsa-miR-196b对BCR-ABL基因表达具有抑制调节作用。这些都为将来进一步研究Hsa-miR-196b的功能及Hsa-miR-196b对BCR-ABL基因的调控作用奠定基础。