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H5亚型AIVs可分为高致病性禽流感病毒与低致病性禽流感病毒,其中高致病性禽流感病毒可感染野鸟,并可在养鸡场内持续爆发,对养殖户造成巨大的经济损失。近些年,H5亚型流感病毒的遗传特性和抗原性上出现了很多新的变化,N2、N3、N5、N6、N8和N9基因片段取代N1基因片段的病毒,其中高致病性H5N6流感病毒自2013年开始在亚洲,特别是东南亚的家禽中频繁出现,已经逐渐代替H5N1成为新的优势流行毒株。当H5N6禽流感病毒在家禽中传播时,接触受感染家禽的人可能会出现散发性感染,甚至导致人的死亡,对公共卫生健康造成严重的威胁。因此,针对不断变异的H5亚型AIVs开展快速准确的检测方法研究具有重要意义。首先,开展了H5N6流感病毒双重荧光RT-PCR检测方法的研究工作。根据H5N6 AIVs HA基因与NA基因核苷酸序列,设计并合成3组HA和4组NA的引物与探针,筛选出一组理想的引物探针,建立了检测H5N6流感病毒的双重荧光RT-PCR检测方法。用H1-H16亚型禽流感病毒评价了该方法特异性,结果显示H5病毒可以在FAM通道、N6病毒可以在VIC通道获得荧光信号,其他亚型流感禽病毒均无荧光信号。用拷贝数为6.9×1010 HA质粒评估检测HA基因的敏感性,可以达到69个拷贝;用拷贝数为8.4×1010 NA质粒评估检测NA的敏感性,可达到84个拷贝。对40份试验感染样品进行检测,其中阳性样品40份,与鸡胚接种的符合率为100%。结果表明,该方法具有快速、特异和敏感的特点,可用于H5N6高致病性流感病毒的核酸检测,本工作为H5N6高致病性流感病毒的监测与防控工作提供了技术支持。其次,开展了H5亚型流感病毒数字PCR检测方法的研究工作。在前期筛选的H5亚型流感病毒HA特异性引物与探针基础上,结合数字PCR工作原理,建立了检测H5亚型流感病毒的数字PCR检测方法。用H1-H16亚型流感病毒评价了该方法特异性,结果显示只有H5亚型流感病毒可以在FAM通道获得扩增,其他亚型流感禽病毒均无荧光信号。与荧光RT-PCR方法比较,dPCR可以达到7.19个拷贝,而荧光RT-PCR为69个拷贝表明建立的d PCR方法比qPCR方法的灵敏度高近10倍。其批内与批间变异系数为2.08%-12.41%,表明建立dPCR方法重复性良好,准确度高。对现地样品进行检测,阳性率为24.2%,与荧光RT-PCR结果100%符合。结果表明,该方法可用于H5亚型流感病毒的核酸检测与核酸标准物质的定量研究,为流感病毒核酸的绝对定量提供新的检测方法。最后,开展了抗H5亚型流感病毒HA蛋白单克隆抗体的制备、测序和重组表达工作。筛选出针对H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白单克隆抗体35株,其中21株单抗重链属于IgG亚型,14株单抗重链属于IgM亚型,轻链都属于κ链。通过竞争ELISA方法的筛选,表明20B3、21D2、22G3具有良好的竞争抑制作用。对所筛选出的3株HA单克隆抗体20B3、21D2、22G3进行免疫球蛋白基因测序,并对测得的序列在体外进行表达,间接免疫荧光实验结果表明3株抗体在体外表达成功,血凝抑制实验表明20B3与22G3这两株单抗具有血凝抑制活性,该方法为后续开展单抗为基础的诊断方法研究奠定了基础。