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邻苯二甲酸丁苄酯(BBP)是比较常见的一种PAEs化合物,因出色的增塑性能,而逐渐被广泛地使用。研究表明BBP有一定的雌激素生物效应和较强的生殖毒性,并且能诱导细胞产生癌变,严重威胁着人类的健康。美国环保局(EPA)与欧盟委员会均将其列入了优先控制污染物的黑名单中。BBP是一种复杂的烷基芳香基邻苯二甲酸酯,在自然环境中彻底矿化的速度比较慢,长期的积累必然会导致一系列的环境问题。但是目前关于BBP生物降解的报道并不多见,因此筛选出高效的BBP降解菌,并对其降解机制进行深入研究具有一定的理论与现实性意义。本研究从武汉市及其周边地区长期受PAEs污染的河泥样品中,分离得到了8株能以BBP作为唯一碳源和能源生长良好的细菌。经过驯化后发现其中一株菌的性状稳定、BBP耐受性好、降解效率高,将其命名为HS-B1。采用形态学观察,生理生化特性分析以及分子鉴定的方法对这株菌进行了初步鉴定,证明为不动杆菌属(Acinetobacter sp.)。实验表明,菌株Acinetobacter sp. HS-B1对BBP降解的最适合培养条件为：温度30-35℃,pH为8.0-9.0；在此条件下,菌株的生长状态良好,BBP降解效率较高；在含有1000 mg·L-1 BBP的无机盐培养基(MSN)中,恒温振荡培养36 h后,培养液的OD600值可以达到1.3,BBP的降解率则超过20%(200mg·L-1)。BBP具有较高的正辛醇-水分配系数,是疏水性较强的有机污染物。采用非离子型表面活性剂Tween-80增加BBP在培养液中表观溶解度,研究其对该菌株的生长以及对BBP生物降解的影响。结果表明Tween-80的添加对该菌株的生长存在一定的抑制作用,但在合适浓度的(0.10mmol·L-1)下可以有效地促进BBP的生物降解,48h的降解效率平均提高了约60%。采用高效液相色谱(HPLC)分析该菌株对BBP的代谢情况,发现HS-B1能够将BBP的彻底降解,中间代谢产物主要是邻苯二甲酸(PA)和苯甲酸(BA)。其中BA在BBP的降解过程中会大量生成并积累,但最后也会被彻底矿化。推测HS-B1对BBP的代谢途径：BBP首先在微生物酯酶的作用下脱去正丁基(C4H9-)与苄基(C6H5CH2-)分别生成PA与苯甲醇(Benzyl alcohol),然后苯甲醇迅速被氧化成BA,同时PA脱去羧基也可以形成BA,最后BA通过开环裂解被彻底矿化,生成H20与CO2。底物广谱性实验表明：除了能够有效地利用BBP之外,菌株HS-B1还对一些常见的PAEs(如DMP、DEP、DBP)以及部分芳香族化合物有一定的降解作用,说明该菌株在处理PAEs类化合物的环境污染治理中具有一定的应用潜力。邻苯二酚1,2双加氧酶是芳香族化合物分解代谢的一个关键酶,能够催化芳香环进行邻位开环。通过设计一对引物,从HS-B1的基因组DNA中PCR扩增,成功获得了其邻苯二酚1,2双加氧酶基因(catA)。HS-B1的catA基因全长921bp,编码306个氨基酸,经Blast比对发现其与鲍曼不动杆菌AYE的catA基因相似性高达99%。采用Neighbor-Joining法构建了catA基因的系统发育树,发现该菌株的catA基因与不动杆菌属(Aci sp.)其他菌株的catA基因相似性很高并聚成一簇,这也证明了菌株HS-B1属于Aci sp.。利用分子克隆手段将catA基因亚克隆至pET-28a中,构建了重组表达载体pET-catA;酶切和测序验证正确后,将重组表达载体pET-catA转入宿主菌E.coli BL21(DE3)中,筛选出阳性克隆子；在18℃、0.05 mmol·L-1 IPTG的条件下诱导表达9h后,经SDS-PAGE分析可以发现,重组菌能够可溶性地表达出一条大小为37 kDa目的蛋白。这为进一步纯化该酶、测定其酶活测定、以及对其进行功能与结构特性研究奠定了良好的基础。