自噬将需要被降解的组分包裹进自噬体,并运送至液泡或溶酶体中降解,对维持细胞稳态及生存至关重要,且自噬水平变化与癌症等多种疾病相关。自噬体形成过程中,许多不同组分的膜结构参与此过程,COPⅡ囊泡在分泌途径中介导内质网至高尔基之间的物质运输,自噬启动后从分泌途径转向自噬途径,参与自噬体的形成。已有文献表明酿酒酵母中COPⅡ亚基衣被蛋白Sec24被Hrr25磷酸化是COPⅡ参与自噬的关键因素。Hrr25属于CK1家族,通过发现CK1家族激酶成员磷酸化靶点是已磷酸化状态的基序,了解到此家族成员特性是磷酸化一些已被上游蛋白激酶磷酸化过的蛋白,因此猜测存在另一蛋白激酶,作用在Hrr25上游,通过磷酸化Sec24蛋白介导COPⅡ囊泡参与细胞自噬。因此本课题针对这一科学猜想,筛选与Sec24互作的蛋白,寻找与Sec24互作的自噬相关激酶。首先通过质谱分析筛选与Sec24相互作用的蛋白激酶。利用质粒p RS305的整合表达功能,改造酵母野生型细胞基因组,使其表达Sec24-13Myc蛋白,免疫沉淀Sec24-13Myc,质谱分析方法找出与Sec24互作的蛋白,筛选出与Sec24互作的蛋白激酶。结果显示,共有1279个比较可信的Sec24互作蛋白,筛选出28个互作的蛋白激酶,其中22个只在诱导自噬后才与Sec24互作;通过文献信息补充,总共筛选出34个候选蛋白激酶与Sec24蛋白相互作用。然后验证与Sec24互作的候选蛋白激酶是否参与自噬。得到与Sec24相互作用的34个蛋白激酶后,排除已被验证与自噬无关的蛋白激酶,筛选出13个存在参与自噬可能性的蛋白激酶作为候选蛋白激酶。通过GFP-Atg8裂解及碱性磷酸酶活性检测实验验证候选蛋白敲除后自噬水平高低。得出结论,13个候选蛋白中,Bub1、Cmk1、Cmk2、Ire1、Pbs2、Rim15及Snf1七个蛋白激酶敲除后,自噬水平减少,说明这些蛋白激酶参与自噬;Cka2、Chk1、Hog1、Kkq8、Yck1及Yck2六个蛋白激酶无自噬表型,可以排除。通过参考候选蛋白激酶与Sec24蛋白互作情况及对自噬影响程度。最后得出结论,筛选出7个可能与Sec24互作的自噬相关激酶,分别是Bub1、Cmk1、Cmk2、Ire1、Pbs2、Rim15、Snf1;其中自噬表型较好的有三个蛋白激酶,Ire1、Rim15、Snf1,存在自噬表型的有四个蛋白激酶,Bub1、Cmk1、Cmk2、Pbs2。本研究通过筛选可能与Sec24互作的自噬相关激酶,为进一步探究Sec24相关蛋白激酶参与自噬提供了新的信息,为深入了解自噬过程提供了前期实验基础。