素心蜡梅体外植株再生及SSR和AFLP反应体系建立

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蜡梅(Chimonanthus)是中国种群中一种典型的物种,它是中国地方树种,是第三纪孑遗植物。蜡梅在中国种植广泛,灌木,树高2.5-3.0米。在北半球,蜡梅冬令开花,黄冠晶莹,清香四溢,花期从次年12月到第二年1月,尤其是在1月中旬开花。蜡梅耐寒,短时期内能耐-18°C的低温。蜡梅为中国特有的花卉植物,品种多,具有较高的观赏价值,发展蜡梅对于改善生态环境条件,提高人民生活水平和增加农民经济收入具有重要的生态、经济和社会意义。本文以素心蜡梅(Chimonanthus praecox Link.var.concolor)为材料,开展其体外植株再生体系建立及SSR和AFLP技术体系建立及引物筛选工作。现将研究结果归纳如下:(1)建立了素心蜡梅体外植株再生体系。蜡梅愈伤组织最适培养基为MS+2.0mg· L-16-BA+0.9mg· L-1NAA,诱导率达到93.5%。不定芽诱导最适培养基为WPM+2.37mg· L-1TDZ+1.48mg· L-1NAA,最高诱导率为71.33%,最适合的生根培养基是用1/2MS+1.5mg· L-1IBA培养30天,生根率达80%。(2)建立了SSR反应体系。通过对影响蜡梅SSR扩增效果的模板DNA,dNTP,引物浓度,Taq酶和退火温度等因素的筛选,建立了其适宜的蜡梅SSR分子标记反应体系,同时筛选了适宜蜡梅SSR扩增引物。结果表明,蜡梅SSR扩增的适宜退火温度为55℃,在20μL反应体系中,蜡梅模板DNA、dNTP、引物浓度分别为5mg· L-1、0.2mmol· L-1和0.5μmol· L-1,Taq酶和10×Taq酶缓冲液量则为2U和2.5μL。利用建立的反应体系,从不同木本植物SSR扩增的417对引物中筛选出了适合蜡梅SSR扩增的41对引物。(3)建立了AFLP反应体系。通过对影响AFLP反应体系的各主要因素的研究,建立了适于蜡梅AFLP分析的技术体系。结果表明,蜡梅AFLP最佳酶切体系(20μL)为模板DNA600ng,Pst I和Mse I各为3U,在37℃下双酶切2h;在20μL最佳连接体系中酶切产物为15μL,3U T4连接酶,0.25μmol·L-1Pst I接头,2.5μmol·L-1Mse I接头,1μL10×T4buffer,在22℃下连接10h;在20μL最佳预扩反应体系中稀释10倍的连接产5μL,2.0mmol·L-1Mg2+,2U Taq酶,300μmol·L-1dNTP,0.5μmol·L-1Pst I和Mse I引物(P+AGA/M+ATC);在20μL最佳选择性扩增反应体系中5μL稀释20倍的预扩增产物,2.0mmol·L-1的Mg2+,2U Taq酶,300μmol·L-1dNTP,0.5μmol·L-1Pst I和Mse I引物(P+AGA/M+ATC)。最后,利用上面的体系筛选出了适宜于蜡梅AFLP分析的96对引物。
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