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紫杉醇(Paclitaxel,或Taxol)是一种从红豆杉(Taxus cuspidate cv.Nana.)中提取和分离出来的天然化合物。由于其对微管的稳定作用而抑制细胞进入有丝分裂和低毒性等特点,所以在人医临床上被广泛用于治疗乳腺癌。近年来的研究表明紫杉醇对免疫细胞具有独特的调节作用,能引起类似于脂多糖所激发的天然免疫和特异性免疫反应。因此,我们假设紫杉醇具有免疫佐剂功能,本论文进行紫杉醇免疫佐剂作用的研究并对其佐剂作用机理进行初步探讨。1、紫杉醇免疫佐剂作用研究目的以卵清白蛋白(Ovalbumin, OVA)作为模式蛋白抗原,研究紫杉醇的佐剂功能,以及对动物免疫平衡的调节。方法试验一：将48只ICR小鼠随机分成6组,生理盐水组和对照组仅免疫10μgOVA,其他组分别设含紫杉醇50μg、100μg、200μg和200μg铝胶组。免疫2次,间隔3周。分别采集一免和二免后2周小鼠血清,检测血清抗OVA抗体IgM、IgG及其亚类。二免后从各组小鼠中分离脾淋巴细胞,采用MTT法检测淋巴细胞增殖和RT-PCR法检测OVA刺激后细胞中细胞因子及其相关基因表达。试验二：将40只ICR小鼠随机分成5组,对照组仅免疫10μg OVA,其他组分别设含紫杉醇100μg、紫杉醇100μg(冻融)和铝胶200μg、铝胶200μg(冻融)组。免疫2次,间隔3周。分别收集一免和二免后2周小鼠血清,间接ELISA法检测血清抗OVA抗体IgG水平。结果试验一中在含10μg OVA的抗原中添加100μg紫杉醇能显著提高小鼠一免和二免后血清中抗OVA特异性IgM和IgG滴度,IgGl,IgG2a,IgG2b,IgG3水平,以及淋巴细胞转化能力(P<0.05),显著促进了淋巴细胞合成细胞因子Interleukin-4(IL-4), Interleukin-10 (IL-10), Interferon-γ(IFN-γ)和Interleukin-12(IL.12)以及促进了GATA-3和T-bet表达(P<0.05),试验二中添加100μg紫杉醇疫苗经过冻融后没有影响到紫杉醇的佐剂效果,而添加200μg铝胶佐剂组在冻融后明显降低了其佐剂效果(P<0.05)。表明紫杉醇具有明显的佐剂作用,并且在调节Th1/Th2平衡上具有剂量依赖性；紫杉醇与铝胶佐剂相比,更具有显著的抗冻能力。2、体内紫杉醇佐剂作用机理研究目的以卵清白蛋白OVA作为模式蛋白抗原,研究紫杉醇的佐剂功能是否通过Hsp90 (Heat shock protein 90),细胞微管蛋白(β-tubulin)和TLR4 (Toll-like receptor 4)介导。方法试验一：将24只TLR4基因突变小鼠C3H/HeJ (TLR4-/-)和24只TLR4基因正常对照小鼠C3H/HeB (TLR4+/+)分别随机分成4组,每组6只。对照组仅免疫10μgOVA,其他组分别设含紫杉醇100μg和25μg LPS组。免疫2次,间隔3周。分别收集一免和二免后2周小鼠血清,检测血清抗OVA抗体IgM、IgG滴度。试验二：将40只ICR小鼠随机分成5组,每组8只。对照组仅免疫10μg OVA,其他组分别设含单独紫杉醇100μg组和50μg格尔德霉素(Geldanamycin)组,以及100μg紫杉醇+50μg格尔德霉素组。在免疫后的第二周从小鼠眼静脉丛采血,检测血清抗OVA抗体IgM、IgG水平。试验三：将40只ICR小鼠随机分成5组,每组8只。对照组仅免疫10μg OVA,其他组分别设含单独紫杉醇100μg组和20μg秋水仙碱(Colchicine)组,以及100μg紫杉醇+20μg秋水仙碱组。在免疫后的第二周从小鼠眼静脉丛采血,检测血清抗OVA抗体IgM、IgG水平。试验四：将40只ICR小鼠随机分成5组,每组8只。对照组仅免疫10μg OVA,其他组分别设含单独紫杉醇100μg组和50μgpifithrin-a(PFT)组,以及100μg紫杉醇+50μg PFT组。在免疫后的第二周从小鼠眼静脉丛采血,检测血清抗OVA抗体IgM、IgG水平。结果试验一显示小鼠TLR4受体突变显著影响到了LPS的佐剂功能(P<0.05),但没有影响到紫杉醇的佐剂功能。试验二显示向紫杉醇佐剂组中添加格尔德霉素后显著抑制了紫杉醇增强OVA特异性抗体水平(P<0.05)。试验三显示向紫杉醇佐剂组中添加秋水仙碱后显著提高了紫杉醇增强OVA特异性抗体水平(P<0.05)。试验四显示向紫杉醇佐剂组中添加PFT后显著抑制了紫杉醇增强OVA特异性抗体水平(P<0.05)。3、体外紫杉醇佐剂作用机理研究目的体外分析紫杉醇诱导巨噬细胞系Nuclear factor kappa B (NF-κB)活化、细胞因子的分泌、共刺激分子表达、调节天然免疫的MicroRNA表达情况以及对细胞内外热休克蛋白的影响。方法试验一：以稳转pNifty-2质粒的RAW264.7细胞为刺激对象,分别向细胞中加入不同终浓度的紫杉醇(0.01、0.1、1、10、100μM)刺激细胞24h,然后从培养基中检测报告基因SEAP(分泌型碱性磷酸酶)的表达。试验二：方法同试验一,采用ELISA法检测细胞分泌的Tumor necrosis factor-a (TNF-a)和interleukin-10 (IL-10)细胞因子。试验三：以10μM紫杉醇分别刺激巨噬细胞2h或4h,通过Quantitative Real-time PCR法分析细胞内miR-155,miR-147,miR-146和miR-132分子表达。试验四：以10μM紫杉醇分别刺激巨噬细胞3 h、6 h、9 h、12 h、15 h、18 h、21 h后,通过Real-time PCR法分析细胞内CD80和CD86分子表达。试验五：以10μM紫杉醇分别刺激巨噬细胞2h、4h、6h、8h后,通过Western blot分析细胞内外Hsp60,Hsp70和Hsp90及其亚型的表达。结果紫杉醇具有活化巨噬细胞NF-κB的能力(P<0.05)；显著提高巨噬细胞共刺激分子(CD80与CD86)表达(P<0.05)；促进了巨噬细胞分泌TNF-a和IL-10(P<0.05)；提高了细胞内miR-155,miR-147,miR-146和miR-132分子表达(P<0.05)；促进了巨噬细胞内热休克蛋白表达和Hsp90-α向细胞内外的释放。结合上一章的试验结果,暗示了内源性Hsp90-a介导紫杉醇的佐剂作用。综上所述,紫杉醇在体外能上调巨噬细胞共刺激分子的表达,促进前炎性细胞因子的分泌,天然免疫调节相关的MicroRNA分子的表达,以及细胞内热休克蛋白的表达和Hsp90-a的释放；体内研究证明了紫杉醇显著提高了小鼠对皮下注射OVA抗原的特异性体液免疫水平和细胞免疫,并具有调节Thl和Th2免疫反应的能力,紫杉醇的佐剂功能发挥不依赖于TLR4受体,可以被格尔德霉素和Pifithrin-a抑制。这些试验结果提示了Hsp90-α介导了紫杉醇佐剂功能,但更进一步的深入研究有助于阐明紫杉醇的佐剂机理。由于紫杉醇独特的佐剂功能和稳定性,加上紫杉醇长期在临床上应用的安全记录,紫杉醇可能是一个比较理想的新候选佐剂。