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乳铁蛋白（Lactoferrin,LF）是一种具有多功能的铁结合蛋白,具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒等活性,广泛应用于食品、化妆品及医药行业中。LF的功能特性,结构解析,异源表达、及其铁饱和度及热敏性的改良一直是国内外研究热点。据文献报道,LF在植物,动物以及微生物细胞体系中表达,重组蛋白具有良好的抑菌活性,但鲜有报道能兼顾LF表达体系的安全性,高效性和重组蛋白的理性设计等研究。本研究根据已报道的LF抑菌肽段的氨基酸序列,结合其铁离子结合和释放的机制,构建牛乳铁蛋白N-叶（BLF-N）及牛乳铁蛋白C-叶（BLF-C）重组枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis168）,实现了二者在细胞内的可溶性表达,研究了其抑菌活性。以抑菌活性更强的BLF-N为研究对象,通过启动子工程和密码子优化等技术,实现BLF-N的高效表达,对BLF-N的Fe3+结合相关位点进行理性设计,提高了蛋白铁饱和度及蛋白热稳定性。最后以铁饱和度和稳定性提高的突变菌为对象,在摇瓶及10 L发酵罐水平上,通过温度和p H调控的二段式发酵工艺优化其细胞生长和蛋白表达水平,主要研究内容如下:（1）实现了BLF-N及BLF-C的可溶性表达并研究了其抑菌活性。钓取BLF-N与BLF-C的目的基因,构建重组菌Escherichia coli BL21/p ET-BLF-N与E.coli BL21/p ET-BLF-C,SDS-PAGE结果显示重组BLF-N与BLF-C均为包涵体。选择5种不同的质粒构建重组B.subtilis168,通过RT-PCR技术,测定了BLF-N在B.subtilis168/p AX-BLF-N、B.subtilis168/p HT-BLF-N、B.subtilis168/p WB-BLF-N、B.subtilis168/p HY-BLF-N和B.subtilis168/p MA-BLF-N中的表达量为6.3、9.8、12.1、10.5和12.0 mg·L-1。BLF-C在B.subtilis168/p AX-BLF-C、B.subtilis168/p HT-BLF-C、B.subtilis168/p WB-BLF-C、B.subtilis168/p HY-BLF-C和B.subtilis168/p MA-BLF-C中的表达量为2.9、5.6、7.1、6.2和8.3 mg·L-1,BLF-N和BLF-C在载体p MA0911中表达量最高。10 mg·m L-1纯化的BLF-C对E.coli JM109、P.aeruginosas和S.aureus的抑制率达100%、100%和48.4%,而200 ng·m L-1的BLF-N对三种菌的抑制率分别为100%、70.3%和41.5%。BLF-C在E.coli JM109、P.aeruginosas、S.aureus中的最小抑菌浓度分别为4、8和16 mg·m L-1,而BLF-N对三种测试菌的最小抑菌浓度分别为128、256和512μg·m L-1,表明BLF-N的抑菌活性远远高于BLF-C。（2）启动子工程和密码子优化提高了BLF-N表达水平并研究了优化后的抑菌性。构建具有不同启动子的重组菌B.subtilis168/p MA0911-Pcat-BLF-N、B.subtilis168/p MA0911-Psac B-BLF-N、B.subtilis168/p MA0911-P43-BLF-N、B.subtilis168/p MA0911-Pveg-BLF-N和B.subtilis168/p MA0911-Pser A-BLF-N。RT-PCR结果表明启动子Pveg、P43和Pser A比Pcat使得m RNA的表达量分别增加240.2%、10.4%和161.5%,蛋白表达量分别增加80.3%、3.5%和55.4%。因此选取B.subtilis168/p MA0911-Pveg-BLF-N用于后续的密码子优化实验,将其16种稀有密码子替换为使用频率最高的同义密码子,构建重组菌株B.subtilis168/p MA0911-Pveg-m BLF-N,密码子优化后m RNA表达量提高164.3%,蛋白质表达量增加52.7%。滤盘板法和Flores-Villase?or法测定抗菌活性,结果显示启动子和密码子优化后不改变BLF-N对E.coli JM109、P.aeruginosa和S.aureus的抑菌活性,这种抑菌活性很可能是由于LF中B分子外部排列的碱性残基破坏革兰氏阴性或阳性细菌的细胞膜所致。（3）铁结合位点的理性改造及提高蛋白稳定性。以启动子和密码子优化后的重组菌株B.subtilis168/p MA0911-Pveg-m BLF-N为研究对象,在BLF-N叶与Fe3+配位形成的扭曲八面体中实施突变D60Y、Y92D、Y192D和H253D。在p H 7.0时,与野生型相比,D60Y突变体有最大的铁结合度为91.3%。组合突变D60Y/Y92D和D60Y/Y192D增强了蛋白对铁的结合力,其中D60Y/Y92D与铁的结合力最强,饱和铁含量分别为93.4%。在p H 7.0时,圆二色谱结果表明野生型的Tm为70.0?C,D60Y/Y92D、D60Y/Y192D突变使得Tm提高了2.0-3.4?C。固有色氨酸荧光光谱法结果表明BLF-N及其突变体荧光发射最大值随着p H的降低逐渐升高,表现出红移。在p H 7.0时,野生型BLF-N、突变体D60Y/Y92D、D60Y/Y192D、Y92D/H253D和Y192D/H253D的荧光发射最大值为332-335nm,它们的色氨酸荧光强度值为13.2-20.4 a.u,其中D60Y/Y92D的荧光发射最大值和荧光强度值最低,说明其红移程度最低,蛋白解折叠的程度低,蛋白结构最稳定。ANS结合荧光强度结果表明BLF-N及其突变体与8-苯胺基-1-萘磺酸盐（ANS）结合后最大发射波长随着p H降低而降低,表现出蓝移,突变体D60Y/Y92D与D60Y/Y192D相比野生型ANS荧光蓝移程度较低,表明蛋白解螺旋的程度低,有更好的结构稳定性。（4）在摇瓶及10 L罐水平上发酵条件优化提高蛋白产量。以铁饱和度和稳定性提高的重组菌B.subtilis168/p MA0911-Pveg-D60Y/Y92D为研究对象,通过摇瓶发酵优化,确定种龄为11 h,4%接种量,以葡萄糖和蛋白胨为最佳碳源和氮源,在发酵0-7 h内,p H 7.5利于重组菌生长,在7-16 h时,p H 7.0更利于蛋白积累。选取28?C作为最适诱导温度,25.5 h为最佳发酵时长诱导表达蛋白,目的蛋白的响应值积分光密度（Integrated Optical Density,IOD）值达68.03%。根据单因素试验结果,选择三因素三水平来进行响应面的优化得到响应值IOD值（Y）与发酵p H（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）3个因素的多元回归方程:Y=-2089.69+441.33A+18.22B+25.34C+0.005AB-0.711AC+0.039BC-30.11A~2-0.31B~2-0.42C~2。对IOD的影响程度依次为发酵时间（29）发酵p H（29）发酵温度。在10 L发酵罐基础上,采用300 r·min-1转速,0-7 h时,设置p H 7.5、30?C条件下培养菌体;7-25 h时,设置p H 7.0、28?C条件下诱导表达,采用温度和p H的二段式调控工艺培养菌体,重组蛋白经纯化后,纯度高达94.3%,最终每升发酵液能制备23.5 mg的BLF-N/D60Y/Y92D蛋白,产量提高了2.4倍。