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环裂解双加氧酶,在芳香族化合物的好氧生物降解中发挥关键作用。自然界中的绝大多数环裂解双加氧酶都属于非血红素单核含铁酶家族,它们通过断裂氧气中的O-O键,随后将其合并到最终产物中,进而完成开环反应。这类反应对于维持全球碳循环以及环境保护具有重要意义。邻氧螯合（Vicinal oxygen chelate,VOC）蛋白超家族中已有许多酶被报道属于环裂解双加氧酶,可以催化芳香族化合物的降解,如外二醇双加氧酶（extradiol dioxygenases,EDOs）,内二醇双加氧酶（intradiol dioxygenases,IDOs）,里斯克顺式二醇双加氧酶（Rieske cis-diol-forming dioxygenase）等。本组前期在研究 chartreusin（Cha）生物合成过程中发现了双加氧酶ChaP,它属于VOC蛋白超家族的新分支,可通过对邻苯醌外侧进行双加氧反应催化底物chartrequinone（Chq）生成产物Cha。在本论文中,基于前期研究基础,我们对双加氧酶ChaP进行定向进化研究。蛋白定向进化依据的原则是组合活性中心饱和测试（Combinatorial Active-site Saturation Test,CAST）和迭代饱和诱变（Iterative Saturation Mutagenesis,ISM）。经过大规模的筛选,我们成功获得可在邻苯醌中间插氧,再进行脱羧反应从而催化底物Chq生成终产物chatric acid A（CaA）的目标突变株。本论文主要对ChaP定向进化的筛选过程,晶体结构,酶促反应所需辅因子以及可能的反应机制进行了探讨。本文的研究内容主要分为以下几部分:第一章,简述目前双加氧酶的主要类别,催化活性以及定向进化的发展现状。第二章,主要讨论双加氧酶ChaP定向进化的建库筛选过程。首先,根据ChaP（PDB:6A4Z）野生型蛋白晶体和小分子模拟对接（docking）结果,在活性中心选择和底物以及金属离子Fe2+有结合的残基位点来进行饱和诱变以及迭代饱和诱变。根据对接结果选择的位点有 D49,Q91,Y92,R102,Y109,H63,F37,R54,H7,Y125,E119。这些位点被分为四组,分别为位点A:D49,Y109;位点B:F37,R102,Q91;位点C:R54,Y92;位点D:H7,H63,Y125,E119。首先从位点A以NNK原则进行饱和诱变,我们成功筛选到了关键位点ChaPD49L。接下来以此为基础,进行迭代饱和诱变。经过层层筛选,我们最终筛选到了 目标突变株,ChaPD49L/Y92A,ChaPD49L/Y92G,ChaPD49L/Y92T,ChaPD49L/Y92。这些突变株可使底物Chq高效率转化成产物CaA,从而改变了野生型ChaP催化的反应类型（主要催化Chq生成Cha）。除此之外,我们还对ChaP突变株反应的pH、温度、辅因子进行了探讨。第三章,为了更好的理解ChaP突变株的催化机制,我们对ChaP突变株进行了蛋白晶体培养。通过一系列培养条件的筛选,我们最终成功获得了 ChaPD49L、ChaPD49L/Y109F和ChaPD49L/Q91C的蛋白晶体并对其结构进行了解析。第四章,为了研究ChaP突变株催化Chq生成CaA的机制,我们进行了一系列实验。1、通过18O2和H218O标记实验证明反应中的氧原子来自于氧气而不是水;2、通过自由基实验,证明了此反应非自由基介导;3、通过蛋白金属离子置换确定ChaP突变株反应活性中心的金属离子是Fe2+或者Fe3+;4,通过低温反应,捕获反应关键中间体;5、通过Chq类似物和ChaPD49L/Y92S的酶反应,确定了 C6-OH和C17-OH对脱酸的重要性。综上,本文首先通过基于CAST和ISM方法完成了对双加氧酶ChaP的定向进化,其次又通过一系列实验探究了 ChaP突变株催化Chq生成CaA的反应机制。