【摘 要】
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【目的】(1) 体外构建血管内皮生长因子VEGF165基因腺病毒载体。(2) 对人骨髓基质干细胞(hBMSc)进行体外培养及扩增,观察其原代及传代细胞的生长特点及生物学特点。(3) 将VEGF165基因
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【目的】(1) 体外构建血管内皮生长因子VEGF165基因腺病毒载体。(2) 对人骨髓基质干细胞(hBMSc)进行体外培养及扩增,观察其原代及传代细胞的生长特点及生物学特点。(3) 将VEGF165基因腺病毒载体共转染hBMSc,观察其表达。(4)观察转染对hBMSc增殖、分化的影响。(5) 观察eGFP示踪转染效率及VEGF165的表达。 【方法】(1) 通过PCR方法人工合成VEGF165的cDNA序列。合成完整的基因序列,测序。合成的VEGF165两端带有EcoRⅠ和BamHⅠ位点,并克隆到pMD18-T载体中,对pMD18-T-VEGF165进行双酶切。把含有pDNR质粒(含eGFP基因)的菌液接种到LB培养基,用试剂盒提质粒,得到的质粒进行EcoRⅠ和BamHⅠ的双酶切。回收5.6Kb左右的片段,与合成的带有EcoRⅠ和BamHⅠ位点的VEGF165连接,过夜连接,转化感受态细胞,挑选单克隆,鉴定,构建pDNR-VEGF165载体。通过Cre-loxP系统介导与pDNR-VEGF165之间的重组。pInt.AV1.spat与pDNR-VEGF165共转化BNN菌株的感受态细胞,在细菌内实现重组。挑选单克隆,进行酶切鉴定,构建pInt.AV1.sPAT.VEGF165腺病毒表达载体。复苏并扩增293细胞。质粒pInt.AV1.SpaT-VEGF165用PMlⅠ和PacⅠ进行双酶切,而pInt.B.B质粒带有腺病毒基因组的骨架序列,pInt.B.B用ClaⅠ的酶切后,得到线性化的pInt.B.B DNA。转染并荧光显微镜观察eGFP的表达,进行重组腺病毒的PCR鉴定,重组腺病毒扩增后氯化铯密度梯度离心法纯化Ad-VEGF165,TCID50 50%组织培养感染剂量法,测定腺病毒滴度。(2) 骨髓取自早产死胎采用全骨髓法进行培养扩增,
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