痘苗病毒是唯一彻底消灭人类病毒性疾病的疫苗。痘苗病毒载体已经被广泛应用于预防艾滋病、疟疾、结核的传播及基因和肿瘤治疗的研究中。　　 痘苗病毒为逃避免疫系统的监视而编码很多干扰宿主免疫系统且往往与毒力密切相关的免疫调节蛋白，这些蛋白包括丝氨酸蛋白酶抑制剂家族同源物、补体控制蛋白、干扰素受体样蛋白、IL-18结合蛋白和肿瘤坏死因子样蛋白等。大量的研究显示特异性的删除这些基因导致了痘苗病毒毒力的降低。痘苗病毒天坛株是中国消灭天花的主要疫苗株，其有效性和安全性已经在实践中得到了充分证明，并已经开始用于疫苗载体的研究中。为进一步增强天坛载体的安全性和免疫原性，本研究选择天坛株编码的免疫调节基因进行研究，这些基因包括TNF受体基因A53R、IL-18结合蛋白基因C12L、丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员B13R和B22R。通过多步克隆的方法构建带有上述目的基因同源臂、痘苗病毒启动子序列pE/L、p7.5及LacZ基因的转移质粒，然后通过同源重组的方法对TV进行单基因缺失突变，获得4株缺失突变体TVC12L、TVA53R、TVB13R和TVB22R。兔皮内毒力实验表明C12L和B13R基因的缺失能显著降低天坛株病毒毒力，尤其以C12L最为显著，下降超过2个Log。小鼠体重模型和CD1乳鼠脑内毒力实验也都证实这些基因的缺失能不同程度降低痘苗病毒的毒力。为进一步评价这些基因缺失对HIV重组疫苗免疫原性的影响，同样通过同源重组的方法对表达HIV gagpol和env基因的重组痘苗病毒VTKgpe进行单基因缺失突变，并成功获得4株突变体VTKgpeC12L、VTKgpeA53R、VTKgpeB13R和VTKgpeB22R。采用同源(rTV/rTV)和异源(DNA/rTV)prime-boost免疫策略并结合肌肉(IM)、腹腔(IP)和滴鼻(IN)的免疫途径免疫小鼠，并对这些重组病毒针对HIV抗原产生的细胞免疫和体液免疫进行评价。结果显示，除VTKgpeB22R产生的免疫应答有所下降外，其它突变体均能够产生相当或稍强于对照VTKgpe的免疫应答水平。　　 抗载体反应是影响病毒作为疫苗载体使用效率的一个重要原因，痘苗病毒的应用也存在同样的问题。考虑到B5R基因编码的膜抗原是诱导机体产生针对胞外包膜病毒EEV的中和抗体的主要抗原，我们假设缺失该基因将使重组病毒能够在体内不被快速清除而能够诱导较强的免疫应答从而克服抗载体反应。在本研究中，我们以TV和VTKgpe为出发毒株，构建了两个缺失突变体TVB5R和VTKgpeB5R。作者发现，免疫TVB5R的小鼠能够部分消除载体反应。同时，在免疫过TV的小鼠中，先免疫DNA疫苗，再免疫VTKgpeB5R的小鼠较免疫VTKgpe的小鼠能增强针对HIV抗原的细胞免疫应答。另外有意义的结果是，缺失B5R基因能够导致TV和VTKgpe显著减毒。作者的实验证实了可以通过基因工程手段对痘苗病毒载体进行改造从而部分克服抗载体反应的问题。　　 基于上述数据和本科室前期的工作基础，作者以缺失B8R基因的VTKgpeB8R为出发毒株，成功构建了VTKgpeB8RC12L和VTKgpeB8RB5R两株双基因缺失重组痘苗病毒。作者希望对这些载体诱导的天然免疫和获得性免疫进行系统评价后能得一个好的天坛痘病毒载体。本研究为最终获得安全性高、免疫原性好和能克服抗载体反应的复制型天坛载体打下了基础。