新生隐球菌是具荚膜的酵母类真菌，可以引起免疫受损患者的隐球菌病。 它分为5个血清型：A，B，C，D，AD。为了区分那些在形态上和生理上不能 区分的菌体，需要一种稳定和敏感的遗传标记，这种标记可以鉴定不同的血清 型并能判断感染的复发和再感染。本研究旨在对新生隐球菌的分子生物学分类 方法进行初步的研究，研究内容包括(1)新生隐球菌原生质体形成和DNA抽 提方法的研究：(a)新生隐球菌菌原生质体形成条件的研究：原生质体的形成是 制备核酸和细胞器如线粒体的重要工具，为了建立原生质体形成的条件，我们 在实验中应用了不同的酶(溶壁酶和 NovoZyme234)、不同的酶浓度 (1，3，5mg/ml)、不同的pH值(4，5，6，7，8)和不同的渗透压稳定剂(蔗糖、 甘露醇和山梨醇)，结果显示对数生长早期的细胞较易形成原生质体，原生质体 形成的最佳条件是以 0．8M的山梨醇为渗透压稳定剂，pH 6.0，5 mM DTT， 3mg／ml NovoZyme 234，孵育 75分钟，在此条件下，原生质体的产量是 98．1％。 溶壁酶的结果与 NovoZyme 234相似。(b)线粒体 DNA的快速抽提和电镜观 察：为了建立新生隐球菌线粒体DNA快速抽提方法并分析其形态学特征，我 们选取对数生长期的细胞，用NovoZym234和机械破壁，通过差速离心的方法 抽提线粒体DNA，并用电镜检查了实验中所获得的菌体、原生质体、线粒体三 部分沉淀，用此法可以得到20μg纯净的mtDNA，由此而建立了一种简单快速 的新生隐球菌线粒体 DNA抽提方法。(c)新生隐球菌基因组 DNA的快速抽 提法的建立和不同抽提方法的比较；DNA是进行分子生物学研究的重要基础。 在本研究中，我们建立了两种简单快速的抽提基因组DNA的方法并可用作PCR 扩增的模板，通过比较四种不同的DNA抽提方法以确定哪种更适合进行下一 步的基因分析，这四种方法是：玻璃珠法，酶法，3％SDS法和氯化苄法。玻璃 珠法是用玻璃珠在混漩器上剧烈振荡破碎细胞壁；3％SDS法是将细胞在含 10mM DTT的3％SDS溶液中加热，然后用 5MKSc和异丙醇抽提，DNA的 产量通过A260测定。结果显示：玻璃珠法是最敏感、重复性好、简单、费用 合理的抽提方法。(2)新生隐球菌5种血清型的CAP64基因的序列分析：多。糖荚膜是新生隐球菌的重要的毒性因子，应用荚膜多糖抗原可以进行新生隐球 二 论文：新生隐球菌分于生物学分类方法的研究 菌的血清分型。本研究分析了5种血清型的CAP64基因的序列的相似性，我0 们扩增了CAP64基因一个约550hp的DNA序列，扩增产物经纯化后克隆到T 载体上，转化至大肠杆菌JM109株中，通过PCR鉴定阳性克隆并测序，5种 血清型 CAP64序列的比较显示其间的碱基差异为 61～glbp，相fi；(，’．’为 83．75％～ 88．03％，其核酸序列的差异是多位点的，生要在 227hp～23 fop之间；氨基酸 的分析结果与此类似。(3)新生隐球菌的AFLP分析：AFLP己经被确认是一 种重复性好、结果可靠的DNA指纹技术，在本研究中，我们将AFLP技术首 次应用于新生隐球苗中并获得了良好的结果，新生隐球菌基因组DNA用双酶 酶切，双链接头连于其酶切末端，用与接头和酶切位点互补的引物扩增DNA 片段，其产物在高分辨的变性聚丙酞胺凝胶上电泳分离，然后进行银染，分析已 来自 5种血清型和临床分离株的 18株新生隐球菌，可见有 30多条大小在 30． 500hP的 DNA－AFLP指纹，相同的血清型有不同的指纹图谱，来自同一患者不 同病期的两株分离株和来自同一患者患者的不同部位的两株分离株都显示出相 同的带型，结果显示了AFLP的高分辨率，它是能提高我们对新生隐球菌认识 的强有力的流行病学工具。