【摘 要】
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大豆对于全世界来说是重要的作物之一,起源于中国,是我国的战略性物资。近几年来,重金属等非生物胁迫是影响大豆生长发育以及产量的重要原因。重金属异戊二烯化相关蛋白（HIPPs）作为一种金属伴侣蛋白在调节植物生理活动中起着至关重要的作用。相关基因HIPP22在烟草中报道可以提高镉耐受性,但在大豆中HIPP22基因关于镉耐受性功能的验证鲜有报道。本研究通过GWAS分析定位得到重金属异戊二烯化相关蛋白基因G
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大豆对于全世界来说是重要的作物之一,起源于中国,是我国的战略性物资。近几年来,重金属等非生物胁迫是影响大豆生长发育以及产量的重要原因。重金属异戊二烯化相关蛋白（HIPPs）作为一种金属伴侣蛋白在调节植物生理活动中起着至关重要的作用。相关基因HIPP22在烟草中报道可以提高镉耐受性,但在大豆中HIPP22基因关于镉耐受性功能的验证鲜有报道。本研究通过GWAS分析定位得到重金属异戊二烯化相关蛋白基因GmHIPP22,以大豆Z070为供试材料,以PCR扩增法克隆GmHIPP22基因,利用相关生信分析软件对该基因进行生物信息学分析;通过实时荧光定量PCR检测GmHIPP22基因响应重金属胁迫的时空表达;以无缝克隆技术构建目的基因过表达载体p CAMBIA3301-GmHIPP22和基因编辑载体CRISPR/Cas9-GmHIPP22,通过农杆菌介导法转化大豆吉农74;对T2转基因植株进行分子生物学检测及镉耐受性功能鉴定。研究结果如下:1、在氯化镉（Cd Cl2）胁迫下,GmHIPP22基因的表达量在胁迫12h时达到最高,先升高后降低;该基因在根、茎、叶中均有表达,表达水平层次为:根＞叶＞茎,根中的GmHIPP22基因甚至超过正常表达水平50余倍;该基因对镉（Cd）格外敏感。经过生物信息学预测可知,GmHIPP22蛋白拥有一个保守的HMA重金属结构域;没有检测到信号肽,说明该蛋白属于非分泌型蛋白;亚细胞定位预测该蛋白可能在细胞质上;该蛋白与花生和白藜芦亲缘关系较近。2、成功克隆GmHIPP22基因,全长732bp,CDS区长度为443bp,编码148个氨基酸,该基因包含一个典型的HMA结构域。3、成功构建目的基因过表达载体和基因编辑载体,并通过农杆菌介导法成功转化受体大豆吉农74,获得T2转基因植株;检测得到T2过表达阳性植株8株,T2编辑阳性植株5株;荧光定量PCR检测T2转基因植株中GmHIPP22基因的表达量,过表达植株中GmHIPP22基因表达量远远高于未转化植株和编辑植株,其表达量是未转化植株3.68倍,是编辑植株的10.8倍;未转化植株中GmHIPP22基因表达量略高于编辑植株,编辑植株表达量约为未转化植株的0.33倍。4、镉胁迫下,过表达植株的株高、地上部分和地下根部鲜重与干重均高于未转化植株,编辑植株则低于未转化植株;过表达植株的根部形态分析表明根长、分枝数、根尖数明显多于未转化植株,编辑植株则少于未转化植株;5、镉胁迫7 d后,过表达植株中SOD、POD、CAT以及APX活性均高于WT植株,而编辑植株中则低于WT植株;另一方面相对电导率、MDA含量、H2O2相对积累量在过表达植株中含量较低,编辑植株中含量较高;重金属镉在过表达植株根部的积累量低于未转化植株,编辑植株高于未转化植株。
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