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记忆缺失性贝毒是某些特殊的藻类产生的一种生物毒素,主要成分为软骨藻酸（Domoic acid, DA）。典型中毒症状是恶心、呕吐、胃痛、头痛、腹泻和记忆缺失。软骨藻酸的主要污染区域位于欧美沿海,虽然我国并未发现软骨藻酸中毒事件,但是加强软骨藻酸的预防和监测工作仍需进行。研究者已经建立了多种方法来检测样品中的DA浓度,包括小白鼠生物检测法、高效液相色谱（HPLC）检测、免疫学方法等。免疫学方法操作简便、便于携带、检出限低、并且可以在若干小时内检测出一批样品,适合现场快速监测。目前我国的免疫学方法的研究远落后于国外,尚无成熟的试剂盒,因此研发出高质量的DA快速检测试剂盒具有非常好的发展前景。本研究利用酶标抗原和抗体的特异性结合,研制了直接竞争ELISA试剂盒。市面上所售的试剂盒多为间接竞争ELISA法试剂盒,需要制备DA与蛋白质的偶联物并进一步加入酶标二抗与抗体反应,检测时间一般在23 h之间,而直接竞争ELISA方法能够有效控制检测时间,将标记物直接标记到抗原上,免去加入酶标二抗,使检测时间缩短至1.5h左右,检出限和检测的精确度均满足检测需求。主要研究过程与成果如下:1.成功制得软骨藻酸与牛血清蛋白、辣根过氧化物的偶联物,浓度分别为6.32 mg·mL-1与8.36 mg·mL-1。通过间接竞争ELISA方法测定单克隆抗体的效价为1:64000。以上制得的抗原、抗体符合进行下一步实验的质量要求。2.通过棋盘滴定法确定直接竞争法的最佳酶标抗原和抗体使用浓度,抗体稀释度1:200,抗原稀释度为1:400; 1%的明胶作为封闭液,温育时间、温度均为37℃温育1h;并且根据固相抗体和游离抗原、酶标抗原的竞争结合这一原理,以浓度的对数和结合率建立标准曲线,得到线性回归方程为y=-0.15608x+0.9866,R2=0.98297,半数抑制率IC50为1.32μg·mL-1,线性范围为51000 ng·mL-1,最低检出限约为3.58ng·mL-1,加标回收率为88.7%136.15%,交叉反应率低;3.根据前期研究结果组装试剂盒,包括抗原稀释液、包被并封闭过的酶标板、洗涤剂、显色剂、终止剂;并对试剂盒的保质期进行测试,确定-20℃可以保存至少6个月;4.使用自制试剂盒对购于上海市铜川路水产市场的上海周边海域的贝类产品进行了测试,结果表明我国DA污染情况较轻,贝类样品中均未检出含有DA。同时使用HPLC对结果进行验证,结果与直接竞争ELISA方法一致;分析直接竞争ELISA方法和HPLC的结果,二者Pearson相关系数达到0.92,t检验的相关性r=0.892,p=0.108>0.05,可以看出,本研究的直接竞争ELSIA与高效液相色谱法有良好的相关性。同时还比较了单克隆抗体直接竞争ELISA法、多克隆抗体间接竞争ELISA法和胶体金试纸条三种方法,相关性良好。总之,直接竞争ELISA方法进一步缩短了检测时间,使用特异性良好的单克隆抗体增强了试剂盒的灵敏度、降低了检出限,可以批量检测,操作方便,易于携带,具有非常广阔的商业前景。