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目的:原癌基因Bmi-1是多梳基因家族中的一员,能调节正常干细胞和肿瘤干细胞的自我更新能力。近年来发现其在多种恶性肿瘤中表达上调。本研究选择高表达Bmi-1基因但缺乏INK4a/ARF位点的肺腺癌细胞系A549作为研究对象,通过沉默Bmi-1基因的表达,来观察其对A549细胞增殖和侵袭转移的作用,并探讨其可能参与增殖与侵袭转移的可能信号传导通路。方法:1、本实验室在前期工作中,构建了四条Bmi-1siRNA,将其转染至HeLa细胞中发现四条链均有抑制HeLa细胞增殖与转移的作用,本实验选择一条最有效的序列作为靶序列和一条随机序列作为阴性对照,合成干扰片段和阴性对照片段,以pSUPERretro- Neo为表达载体,构建重组逆转录病毒siRNA表达载体。2、将重组载体转染入A549细胞中,筛选出稳定转染的单克隆细胞扩大培养。3、应用RT- PCR和Western Blot方法检测对Bmi-1基因的沉默效果。4、应用MTT比色法、台盼蓝拒染法及平板克隆形成实验检测沉默Bmi-1基因的表达后对A549细胞增殖的影响。5、利用流式细胞仪分析各组细胞的细胞周期。6、应用Transwell实验检测沉默Bmi-1基因表达后对A549细胞体外迁移能力的影响。7、应用侵袭实验检测沉默Bmi-1基因表达后对A549细胞体外侵袭能力的影响。8、通过裸鼠腋窝皮下接种各组细胞,观察沉默Bmi-1表达后A549细胞在裸鼠体内的致瘤能力的影响。9、将各组细胞从尾静脉注射到裸鼠体内,观察沉默Bmi-1基因表达后对A549细胞转移能力的影响。10、western blot检测PTEN、total-AKT、pho-AKT、cyclinD1蛋白表达、明胶酶谱法检测MMP2和MMP9的表达和ELISA法检测VEGF的表达。结果:1、逆转录病毒介导的Bmi-1siRNA有效的沉默了Bmi-1基因的mRNA和蛋白的表达。2、MTT及流式细胞仪结果显示,沉默Bmi-1基因的表达能够抑制A549细胞的增殖,细胞周期阻滞于G1期。3、克隆形成实验表明沉默Bmi-1基因的表达明显抑制了A549细胞的单细胞增殖能力。4、沉默A549细胞Bmi-1基因的表达后在体外能明显抑制其转移侵袭能力。5、体内成瘤实验表明沉默A549细胞Bmi-1基因表达后使A549细胞在裸鼠体内的致瘤能力下降。6、沉默A549细胞Bmi-1基因表达后在裸鼠体内能抑制A549细胞的肺部转移能力。7、沉默Bmi-1基因的表达后A549细胞中PTEN蛋白增加,pho-AKT、cyclinD1蛋白表达降低而total-AKT蛋白表达无变化。8、沉默Bmi-1基因表达后A549细胞培养上清中MMP-2、MMP-9和VEGF分泌减少。结论:沉默Bmi-1基因表达在体外抑制了A549细胞的增殖、迁移及侵袭能力,在体内减弱了裸鼠成瘤能力,我们推测,Bmi-1在调控INK4a/ARF位点缺失的A549等肿瘤细胞中,可经由非经典下游位点来调控cyclinD1表达的方式参与该类肿瘤细胞的增殖,PTEN和pAKT可能参与了该通路;Bmi-1与A549细胞的侵袭与转移密切相关,其参与该肺腺癌细胞的侵袭与转移有可能是通过调控MMPs及VEGF来完成的,而不是通过上皮细胞间质化(EMT)来实现的。