目的本课题将细胞移植与基因治疗相结合,将携带HCN2基因的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)自体移植入完全性房室传导阻滞动物模型的希氏束损伤区,探索治疗完全性房室传导阻滞的新方法。方法(一)猪MSCs的分离、培养与鉴定获取实验猪骨髓,密度梯度离心后以流式细胞仪分选培养MSCs,每72 h换液1次,细胞融合达90%传代培养；观察培养细胞的形态学特点,绘制细胞生长曲线并计算细胞倍增时间；通过流式细胞仪检测细胞表面标志CD105、CD73、CD90、CD45、CD34、CD14及CD19；将MSCs置入成脂肪、成骨、成软骨诱导培养基进行诱导分化并鉴定分化细胞的性质。(二)Ad.HCN2-GFP转染MSCs构建起搏细胞构建Ad.HCN2-GFP并测定滴度,转染Hela细胞以确定其安全性；Ad.HCN2-GFP以不同感染倍数(multiplication of infection, MOI)转染MSCs后检测转染效率,确定最佳MOI；流式细胞仪检测检测MSCs感染Ad.HCN2-GFP后HCN2表达率并绘制时间曲线；检测Ad.HCN2-GFP转染MSCs后细胞活力与细胞倍增时间的变化；免疫荧光检测HCN2通道蛋白表达；全细胞膜片钳技术行电生理学检测；分离培养乳鼠心肌细胞(neonatal rat’s cardiomyocytes, NRCs)并行免疫组织化学鉴定；联合培养转基因MSCs和NRCs,观察细胞搏动情况并记录收缩频率并行抗缝隙连接蛋白43(Connexin43, Cx43)免疫荧光染色。(三)自体起搏细胞希氏束内移植治疗完全性房室传导阻滞实验猪在全麻机械通气下,经胸射频消融希氏束建立完全性房室传导阻滞动物模型；实验组将Ad.HCN2-GFP转染的自体MSCs移植于希氏束损伤区域,阳性对照组将Ad.HCN2-GFP转染的自体MSCs移植于右室前壁内,阴性对照组将Ad.GFP转染的自体MSCs移植于希氏束损伤区域；术后给予临时起博器保护,1周后去除起搏器,常规行体表心电图和24 h动态心电图检查；行超声心动图检查以明确心脏射血功能及收缩同步情况；对细胞移植部位的希氏束心肌标本行HE染色及抗Cx43免疫荧光染色。结果(一)猪MSCs的分离、培养与鉴定从骨髓分离得到的MSCs活细胞百分率为94.2%。倒置相差显微镜下观察,刚接种的细胞在倒置相差显微镜下体积较大,呈球形,悬浮于培养液中。大小不一,胞体透亮且折光性强。3h后开始贴壁,16h贴壁细胞明显增多,48 h后大部分细胞己贴壁。经流式细胞仪分选传代后,生长较快,2h内即开始贴壁,8h后基本贴壁,24 h内完全贴壁,3-4 d后细胞基本融合,约7天可传一代。连续传9至10代,细胞的形态无明显变化。MSCs生长的第3、5、10代,细胞生长曲线均呈S状。第3、5、10代MSCs的细胞倍增周期分别约为36,38和48小时。流式细胞仪检测结果显示MSCs对CDl05、CD73、CD90表达均为阳性,CD45、CD34、CDl4及CDl9表达弱阳性。MSCs在不同的诱导环境下,可分化成脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞。(二)Ad.HCN2-GFP转染MSCs构建起搏细胞成功构建重组腺病毒Ad.HCN2-GFP,滴度为1.5×109pfu/ml。HeLa细胞未出现致细胞病变效应(cytopathic effect, CPE)。以Ad.HCN2-GFP转染MSCs后,48-72 h后荧光显微镜下可见细胞呈绿色荧光。不同的MOI值得到不同的转染效率。随着MOI值的增加,GFP阳性细胞比率也增加,显微镜下细胞表达绿色荧光更强。MOI=100时,MSCs转染率约为95%,同时细胞状态明显优于MOI=150、200的细胞状态。Ad.HCN2-GFP转染MSCs后行抗HCN2免疫荧光染色,荧光显微镜下可见荧光,证实有HCN2蛋白表达。转染后第一周、第三周、第五周时细胞活力差异不显著(P>0.05)。流式细胞仪检测结果显示,Ad.HCN2-GFP转染后MSCs细胞膜上HCN2通道蛋白高表达,表达比率在第一周最高,之后随时间延长逐渐下降。全细胞膜片钳证实转染细胞能产生If。MSCs与已培养5天的NRCs联合培养,48hr即可看到细胞协调同步收缩,在为期10天的观察中,实验组细胞搏动频率大于阳性对照组、阴性对照组和空白对照组(P<0.01)。行抗Cx43免疫荧光染色后,荧光显微镜下可见MSCs与共培养的NRCs之间存在荧光。(三)自体起搏细胞希氏束内移植治疗完全性房室传导阻滞经胸射频消融成功建立完全性房室传导阻滞动物模型,体表心电图可见P波与QRS波完全分离,心房率快于心室率,交界性逸搏心率<50次／分。细胞移植后一周后去除起搏器,心电图及24 h Holter检查显示细胞移植后实验观察期间所有动物仍为交界性心律,未见房室传导恢复,但实验组及阳性对照组心率在一周内即增快,第二周以后逐渐减慢,至第六周仍高于移植时水平。阴性对照组动物心率在各时间点无明显变化(P>0.05)。电生理仪测量QRS波宽度显示阳性对照组QRS波群较宽(P<0.01)。移植后第四周超声心动图检查示三组的左室射血分数(left ventricle ejection fraction, LVEF)比较差别不显著(P>0.05),而阳性对照组的心室间激动延迟时间(interventricular mechanical delay, IVMD)及间隔-左室后壁收缩延迟时间(septal-to-posterior wall motion delay, SPWMD)与其余两组均有显著的差别(P<0.01)。组织学研究显示细胞注射部位希氏束心肌组织间隙可见单个核细胞成簇散在分布,未发现明显胶原纤维增生。免疫荧光检测可见移植细胞与心肌细胞间Cx43表达。结论一、MSCs取材广泛,分离方法简单,扩增能力强,传代培养易于获得大量有分化能力的细胞。MSCs表达CD105、CD73和CD90,不表达CD45、CD34、CD14及CD19,显示其具有间充质干细胞的特性,同时证明其为非造血类细胞。成脂、成骨及成软骨诱导结果证明所获取的MSCs是具有多向分化能力的干细胞。二、Ad.HCN2-GFP可以安全、有效的转染MSCs构建起搏细胞。转染后MSCs细胞活力无明显变化,细胞膜上高表达HCN2通道蛋白,表达比率随时间减小。全细胞膜片钳证实转染细胞能产生If。与NRCs联合培养,携带HCN2基因的MSCs能有效起搏NRCs,且MSCs和NRCs之间可形成缝隙连接。三、转HCN2基因的MSCs自体移植入完全性房室传导阻滞动物模型的希氏束损伤区中后,可以存活并有效起搏心室。提升心率的效果与移植入阳性对照植组相当,且两组心律均起源于细胞移植区。在移植后6周内,心率呈先上升后下降趋势,高峰在2周左右。起搏细胞希氏束内移植较右室前壁移植可以提供更协调的左右心室及左室内的激动顺序。MSCs移植入心肌后由于注射压力及其后的细胞迁移,会散在分布在心肌组织间隙中,而不会整齐排列在注射区域内,更无法保证连接损毁区两端的正常传导束心肌细胞。因为这种空间接续性的丧失,它们虽然可以存活且与相邻心肌细胞形成缝隙连接,但无法恢复房室间的电传导。