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膜蛋白在细胞跨膜信号转导中发挥着关键作用,是重要的药物靶点。膜蛋白合成后,需要在生物膜中正确折叠才能发挥其生物学功能,生物膜对膜蛋白的折叠、稳定性和生物学功能具有重要影响。膜蛋白天然表达量往往较低、疏水性强、难以制备,因此关于膜蛋白结构与功能的研究受到较大限制。关于生物膜如何影响膜蛋白的性质与折叠过程以及在体外膜蛋白如何与生物膜重组等问题,对于深刻理解膜蛋白结构与功能,以及膜蛋白靶点相关的药物设计和疾病治疗具有重要意义。关于这一类问题虽已有不少研究,但进展还相当有限,还有待于更系统、深入的研究。细菌视紫红质（bacteriorhodopsin,b R）是盐沼盐杆菌紫膜上的唯一蛋白,具有7次跨膜螺旋结构,该蛋白具有很好的稳定性,其折叠/去折叠过程完全可逆,是研究七次跨膜蛋白结构与功能的重要模型蛋白。本论文以b R为模型蛋白,对于b R的蛋白制备、在磷脂模拟生物膜中的插膜取向以及折叠过程进行了系统研究。针对七次跨膜蛋白疏水性强、难以制备的问题,我们首先探索了盐沼盐杆菌同源表达和大肠杆菌异源表达两种方法制备细菌视紫红质。其中,以p BA2为细菌视紫红质bop基因载体,转化进入盐沼盐杆菌MPK409宿主细胞,构建了盐沼盐杆菌表达体系,可以获得2 mg/L纯度为98%以上的b R蛋白。同时,还构建了p TWIN1-CBD-intein-b O/BL21大肠杆菌（E.coli）三元表达体系,用于表达脱辅基细菌视紫红质（bacterio-opsion,b O）,重组菌株在OD600nm=1.2-1.4时,用0.1m M IPTG,18℃诱导表达20 h,融合蛋白表达量可达每升培养基450 mg。该表达融合蛋白通过intein自裂解、镍柱亲和层析和几丁质亲和层析法纯化蛋白,最终可以获得纯度95%、产量为每升培养基270 mg b O。制备的b O蛋白在DDM（N-dodecyl-β-D-maltoside）胶束或DOPC（1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine）脂质体囊泡中均能与视黄醛成功重组。膜蛋白在生物膜中正确的插膜取向,是它们发挥生物功能的重要前提。本论文以细菌视紫红质为模型,利用荧光猝灭滴定实验对b R在模拟膜中的插膜取向进行研究,考察了磷脂类型、溶液p H、离子强度、生物膜曲率等因素对b R插膜取向的影响。结果发现,在所研究的影响条件中,对b R插膜取向影响最大的因素是脂质类型,即b R在POPC形成的囊泡中,蛋白的N端更倾向于朝向囊泡内部（x=0.64±0.03）（x代表N端朝内的几率）;而在POPG分子组成的囊泡内,蛋白的C端更倾向于朝向内部（x=0.41±0.01）;b R在DOPC膜中没有明显优先取向（0.53±0.01）。p H值和离子强度也对b R在囊泡中的取向有影响,它们可能是通过调节静电相互作用影响b R插膜取向;而膜曲率对b R在膜中的取向影响最小。通过对比b R在折叠和去折叠状态下的插膜取向,发现b R折叠态和未折叠态对其插膜取向没有明显影响。该研究为深刻理解膜蛋白在体外的插膜过程及其调控奠定了实验和理论基础。针对膜蛋白在生物膜中的折叠过程,我们系统研究了细菌视紫红质在不同粒径脂质囊泡中折叠的热力学稳定性和去折叠动力学。结果发现,b R在58 nm、79nm、122 nm和165 nm的POPC囊泡粒径中D50%（b R达到50%变性时的SDS浓度）分别为0.138±0.003%、0.132±0.002%、0.117±0.001%和0.096±0.004%,即其变性D50%随着囊泡粒径的增加而减小,这也意味着b R的热力学稳定性随着囊泡粒径的增大而减小,即膜蛋白曲率减小,蛋白的热力学稳定性降低。另外,随着POPC囊泡粒径尺寸的增大（分别为79 nm、122 nm和165 nm）,b R去折叠快过程的弛豫速率常数分别为0.009±0.002 s-1、0.0098±0.0025 s-1和0.018±0.003 s-1,b R去折叠的弛豫速率常数增大,即去折叠速率增大（曲率减小）。这提示我们可以通过改变膜的曲率来调控膜蛋白在生物膜中的折叠速率。此外,我们还采用基因定点突变技术,构建了一系列b R蛋白双突变体,经蛋白提纯和荧光标记,初步采用单分子荧光技术对b R突变体V130C-A196C、Y64C-V130C和b O突变体0C-249C的去折叠过程进行检测。发现随着SDS浓度的增加,可以清楚地检测到突变体Y64C-V130C有多种折叠中间状态的存在。而在DDM胶束中,没有视黄醛存在的情况下,低浓度的变性剂SDS就可以将b O突变体0C-249C蛋白完全变性。本论文为进一步阐明相关膜蛋白折叠及体外插膜机制,深入理解膜蛋白结构与功能提供了新的实验依据,为有效调控膜蛋白与磷脂囊泡的体外重组提供理论基础。