近年来基因工程抗体成为现代生物学及医学领域的研究热点,具有不可估量的市场前景。如何经济高效地表达具有活性的抗体分子,成为基因工程抗体研究中亟需解决的问题。目前CHO表达系统发展较成熟,在抗体表达中应用广泛,然而该系统培养要求精细、操作复杂、容易污染,具有较高的生产成本。E.coli表达系统具有遗传背景清楚、生长繁殖快、表达量高、工艺简单、节约成本等诸多优点。但是全长抗体分子需要依靠二硫键正确配对形成完整的结构,而E.coli细胞质内的高度还原状态使其应用于抗体表达时无法形成稳定的二硫键,不能进行正确的氧化折叠。此外,E.coli缺乏有效的糖基化系统,不能对抗体进行糖基化修饰。因此基于大肠杆菌表达系统,构建一种可促进二硫键正确配对,且能够对外源蛋白进行糖基化修饰的新型表达系统具有重要的意义。Red同源重组系统利用Exo、Beta、Gam 3种同源重组酶以及含有短同源臂的线性DNA打靶片段,通过简单的操作即可在E.coli基因组上实现精确的基因敲除或敲入。CRISPR-Cas9基因编辑系统是近年来迅速发展并得到广泛应用的一种高效基因编辑系统,该系统靶点分布频率高、设计简单、操作简单,可在原核及真核细胞基因组的任何位置进行高效、特异、多种形式的基因编辑。本研究旨在对E.coli基因组进行基因改造,获得一种可在细胞质中形成二硫键的表达菌株;利用该菌株进行全长抗体表达并验证其性质;在可促进细胞质中二硫键形成菌株的基础上,进行E.coli糖基化系统构建的初步尝试。首先,利用Red同源重组系统,先后敲除编码硫氧还蛋白还原酶的trxB基因及编码谷胱甘肽还原酶的gor基因;利用CRISPR-Cas9基因编辑系统,将去掉信号肽的DsbC编码区及T7表达调控元件整合至E.coli基因组,在细胞质中过表达具有分子伴侣活性的二硫键异构酶DsbC,使细胞质呈高度还原状态并促进二硫键正确配对,获得了可在细胞质中形成二硫键的E.coli蛋白表达菌株TGD。其次,以含有双表达框的pET-duet为载体,构建了两种抗乙肝病毒表面抗原的抗体23E7和HUE6F6的轻重链共表达质粒;利用本研究构建的菌株TGD、NEB公司可促进细胞质中二硫键形成的菌株SHuffle以及本研究出发菌株ER2566,分别进行抗体23E7和HUE6F6的表达;三种抗体表达菌株菌体形态相似,生长状况无明显差异;表达所得抗体经protein A亲和层析后达到较高纯度;抗体23E7在TGD菌株中表达量为SHuffle和ER2566菌株的6.4倍,抗体HUE6F6在TGD菌株中的表达量为SHuffle和ER2566菌株的4.1倍,TGD菌株中的两种抗体的表达量明显提高。第三,利用SDS-PAGE、Western blot、分子排阻色谱、分析型超速离心、抗原结合活性评价、病毒中和活性评价等多种方式,对TGD菌株、CHO细胞、SHuffle菌株及ER2566菌株表达的两种抗体进行了性质检测与比较。与SHuffle和ER2566菌株相比,TGD菌株表达的抗体可形成四聚体形式的完整抗体,组分单一,纯度较高,抗原结合活性及中和活性均强于SHuffle和ER2566菌株表达的抗体。最后,利用Red同源重组系统,对E.coli中编码O-抗原连接酶的waaL基因进行敲除;将空肠弯曲菌中编码寡糖转移酶的pglB基因构建至pTO-T7载体,使其在E.coli中表达;利用该糖基化改造菌株表达的抗体可检测到明显的寡糖信号,可能含有初步的糖基化修饰,为E.coli中N-连接糖基化系统的建立提供了参考。综上所述,本研究构建的细胞质呈氧化状态且能促进二硫键形成的E.coli菌株可高效表达全长抗体,为利用E.coli进行全长抗体表达的相关研究奠定了基础;空肠弯曲菌N-连接糖基化系统的引入为E.coli中糖基化系统的建立提供参考,有望构建出一种既可促进二硫键正确配对又能进行糖基化修饰的新型原核表达系统。