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背景和目的:微小RNA-155(miR-155)在子痫前期患者胎盘组织的表达量较正常孕妇显著升高,miR-155可调控细胞周期蛋白的表达。本实验主要研究不同表达水平的miR-155通过靶向调节细胞周期蛋白影响人滋养细胞的增殖。
方法:通过生物信息学检索发现,细胞周期蛋白D1(cyclin D1)是miR-155的靶基因之一。将PCR扩增的miR-155基因片段(单拷贝和双拷贝)克隆于pEGFP-C1质粒中,构建不同miR-155基因拷贝数的重组质粒pEGFP-miR-155;实验分单拷贝组,双拷贝组和对照组三组,分别将含单拷贝、双拷贝miR-155基因片段的pEGFP-miR-155和pEGFP-C1空载体转染入人滋养细胞株HTR-8/SV neo中;转染后24h,利用实时定量PCR检测细胞内miR-155和cyclin D1 mRNA的表达,Western-Blotting检测cyclin D1蛋白水平的表达;利用流式细胞技术检测HTR-8/SV neo细胞周期;CCK-8试剂盒检测HTR-8/SV neo细胞增殖能力。
结果:转染24h后,单拷贝组和双拷贝组miR-155的表达分别较对照组上升1.54±0.09和2.15±0.12倍,且双拷贝组显著高于单拷贝组(P<0.05,n=5);单拷贝组和双拷贝组cyclin D1 mRNA的表达水平分别是对照组的0.6±0.05倍和0.39±0.02倍,且双拷贝组显著低于单拷贝组(P<0.05,n=5)。对照组,单拷贝组和双拷贝组HTR-8/SV neo细胞G1期分别为44.9±3.22%,49.5±1.25%和52.9±4.23%,S期分别为44.1±2.36%,41.0±2.12%和36.9±1.85%;单拷贝组和双拷贝组的细胞增殖活力分别为对照组的79.13±4.5%和59.52±3.3%。单拷贝组和双拷贝组cyclin D1 mRNA水平和蛋白水平分别较对照组明显降低,且双拷贝组降低更明显。
结论:miR-155可在体外下调细胞周期蛋白cyclin D1的表达,抑制人滋养细胞的增殖,使细胞停滞在G1/S期,这种抑制作用与miR-155表达水平呈正相关。