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许多农作物，尤其是一些果品和蔬菜，不仅在田间栽培过程中，而且在收获后的冷藏、冻藏和速冻加工过程中都会遇到冷冻伤害。然而，用常规的育种方法来改良作物的抗寒性会遇到许多困难。随着分子生物学的发展，基因克隆技术逐步介入植物抗寒研究，而率先进入该领域的基因即为极区鱼类抗冻蛋白（antifreeze proteins AFPs）基因（afp）。 自二十世纪80年代，鱼类的afp结构被研究清楚以后，人们先后将其afp转入郁金香、烟草、油菜、玉米、番茄、马铃薯等作物，力图提高这些作物的抗寒性，取得了一些有益的结果，但离人们的期望还相差较远。 1998年10月英国York大学的Dawn Worrall等发表了胡萝卜AFP及其基因的论文，标志着第一个植物afp基因的发现，对于植物抗冻基因工程具有非常重要的意义。他们不仅测定了胡萝卜AFP的体外热滞值及重结晶抑制活性，而且将其cDNA连接在表达载体的双CaMV 35S启动子之后导入烟草，获得了正确表达。 本研究用PCR的方法克隆了胡萝卜afp，构建了其植物表达载体，并用农杆菌介导法将其导入番茄之中，初步获得了转化植株。 以英国胡萝卜变种var. autumn King，中国胡萝卜变种var. sativus Hoffm Deutschl的3个地方品种——宁夏吴忠胡萝卜、陕西华县胡萝卜和陕西汉中胡萝卜为材料，用PCR方法克隆了抗冻蛋白基因afp，发现afp在所试材料中普遍存在。用宁夏吴忠胡萝卜的afp核苷酸序列和英国胡萝卜var. autumn King的afp进行了对比，在所测1004个核苷酸中，有35个碱基不同，其中无义突变20个，有义突变15个，按有义突变计，同源性为98.5％。 以克隆到的var. autumn King的afp为目的基因，以pUCm-T Vector为载体，构建成胡萝卜afp的克隆载体pTAF。用EcoRI消化重组质粒pTAF使其线性化，再用DNA聚合酶ⅠKlenow大片段补平末端，然后用XbaⅠ消化，获得一末端粘，一末端平的目的片段（afp）。植物表达载体pBI121用XbaⅠ和SmaⅠ双酶切，获得一末端粘，一末端平的线性质粒。将目的片段与线性质粒在T4DNA连接酶的作用下进行定向连接，构建成胡萝卜afp的植物表达载体pBAF。用直接转化法将重组子pBAF导入根癌农杆菌LBA4404。 以番茄‘ZF’的子叶和下胚轴作为外植体，对细胞分裂素与生长素的7个组合进行了比较试验，确定MS+BA 1.0mg/L+IAA 0.2mg/L为最佳生芽培养基。最佳生根培养基为MS+IAA 0.05mg/L。 番茄无菌苗出芽后 5——7天，子叶切成 0．scm X 05cm片段，下胚轴切成 Icm节 段，于生芽培养基26℃260o LW预培养24h。农杆菌LBA4404过夜培养，用Ms培 养液稀释 10——20倍，侵染外植体 smin，28 ’C黑暗共培养 48h。然后在 MS＋BA l刀mg／L＋IAA 0．Zot＋Kan 25mg／L＋cef 200mg／L筛选培养基上诱芽，每两周转接 1 次。芽长至Zcm时，切下转至＊S＋M人0刀smN＋Kan 12．sin叭Ce门伽恤叭培养基 上生根。 到目前为止，877个外植体共获得不定芽221个，已转至生根培养基上80个， 获得生根幼苗 12株，对 IO株生根幼苗进行了 PCR检测，其中 2株呈阳性，初步证 明胡萝卜吻基因已经导入该两株番茄体内。