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隐孢子虫病是一种重要的人兽共患的原虫病，该病分布广、感染率高且危害严重，目前已有200多种药物用于该病的治疗，但还没有一种具有真正的杀灭作用，以单链抗体为导向物的重组毒素已成功地用于肿瘤的治疗，为了探讨其对隐孢子虫的杀灭作用，特进行如下研究： 抗隐孢子虫子孢子表膜单克隆抗体的制备及鉴定 利用牛源微小隐孢子虫(C．parvum)超声粉碎物免疫BALB／C小鼠，取其脾细胞与SP2／O细胞融合，经3～5次有限稀释克隆化，获得4株持续分泌抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为1D5，2E9，3D6和4G4。经检测，其分泌的抗体亚类1D5、3D6和4G4株为IgG1，2E9株为IgM。通过免疫荧光鉴定，4株单抗均作用于子孢子，其中2株针对子孢子表膜。对杂交瘤细胞株的染色体计数的结果发现染色体均数为90～98条。ELISA检测3D6、1D5、2E9和4G4的细胞培养上清效价分别为1：160，1：320，1：320和1：640，诱生小鼠腹水的抗体效价分别为1：409，600，1：819，200，1：819，200和1：1，638，400。 抗隐孢子虫子孢子单链抗体基因的克隆及序列分析 从分泌抗隐孢子虫子孢子单克隆抗体的杂交瘤细胞3D6和4G4中，分别提取其mRNA，在反转录酶的作用下，合成cDNA，经PCR扩增，分别获得抗隐孢子虫子孢子表膜单克隆抗体的轻、重链可变区基因V_L和V_H。在这两个基因中加入连接肽基因后，经进一步PCR扩增、组装合成出单链抗体(ScFv)基因，将该两个基因克隆入pMD-18T载体后，进行了序列测定。测序结果表明，获得的单克隆抗体轻、重链可变区基因V_L和V_H符合小鼠抗体可变区基因特征，为功能性重排的鼠抗体可变区基因序列，分离得到的单链抗体基因ScFv由重链可变区基因V_H-连接肽基因-轻链可变区V_L基因构成，这种构成模式较V_L-Linker-V_H基因结构具有更强的抗体亲和活性。3D6 ScFv基因全长为720bp，其中V_H基因为351bp，编码117个氨基酸，V_L基因全长为324bp，编码108个氨基酸。4G4 ScFv基因全长为717bp，其中V_H-基因为348bp，编码116个氨基酸，V_L基因全长为324bp，编码108个氨基酸。 抗隐孢子虫重组毒素ScFv-PE表达载体的构建 将获得的ScFv基因分别代替绿脓杆菌外毒素PE的受体结合区，利用原核表达载体pET28，构建了用于表达重组毒素的两个原核表达质粒3D6pET28-ScFv-PE和4G4pET28-ScFv-PE。 抗隐孢子虫重组毒素ScFv-PE在大肠杆菌中的表达 将上述质粒转化受体菌BL21(DE3)后，经IPTG诱导，成功地表达了目的蛋白。重组毒素3D6ScFv-PE40和4G4ScFv-PE40的表达量分别占菌体蛋白总量的14％和12％，表达产物以包涵体和上清两种形式存在。 抗隐抱子虫重组毒素ScFv一PE活性的检测将低温诱导获得的3D6ScFv一PE可溶性表达产物，加入含有脱囊后的子抱子的1640培养液中，观察18h内活动的子抱子数目和活动性的变化，结果与对照组相比，加入重组毒素组活动的子抱子数目明显减少(P<0 .05)，活动性明显降低，提示重组毒素对隐抱子虫子抱子具有较强的杀灭作用。