人脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,具有致残率、致死率高,复发率高及治愈率低的特点,其中高级别胶质瘤中位生存期仅为14-17个月,预后极差,严重威胁着人类的健康。目前,胶质瘤的治疗方式为手术切除联合放疗及替莫唑胺化疗等综合治疗,然而由于胶质瘤细胞呈侵袭浸润性生长,与周围脑组织界限不清,手术难以做到完全根除,同时放疗和化疗又存在难以逆转的严重抵抗和耐药性。因此,急需寻找新的有效策略来走出这个困境。近年来,随着神经生物学和神经免疫学发展的不断深入,肿瘤免疫疗法取得了长足进步。抗肿瘤免疫治疗可以通过靶向特定的肿瘤细胞,进行精准的免疫杀伤,其特异性高,且具有免疫记忆杀伤效应,从而能够显著抑制肿瘤的增殖、转移和复发,因此成为了目前肿瘤研究的焦点。免疫检查点分子(Immune Checkpoint molecules)是目前抗肿瘤免疫治疗领域关注度最高的膜受体蛋白,由他们组成的共刺激信号和共抑制信号共同保持平衡,从而精细调控机体的免疫系统。免疫检查点配体和受体之间的相互作用可通过一系列细胞内信号通路的作用来上调或下调淋巴细胞的活性。肿瘤可以利用负性免疫检查点分子来抑制免疫细胞的效应功能,削弱抗肿瘤免疫反应,最终发生免疫逃逸。此外,免疫检查点分子还可通过抑制辅助性T细胞(T helper cells,TH)的活性,以及增强髓系来源抑制性细胞(Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)及调节性T细胞(Regulatory cells,Tregs)的免疫抑制能力,参与形成肿瘤免疫抑制微环境。因此,免疫检查点受体和其相应的配体便成为免疫调控和药物开发的最佳靶点。近年来,以免疫检查点抑制剂为代表的免疫治疗在多种恶性肿瘤中取得了良好的治疗效果。这些药物通过封闭免疫检查点分子及其通路,恢复T细胞功能,逆转其“耗竭”和无能化,从而激发了高效的抗肿瘤免疫反应。T细胞免疫球蛋白粘蛋白3(T-cell immunoglobulin and mucin domain 3,Tim-3)属于Tim家族中的一员。Tim-3作为新发现的免疫检查点分子在慢性感染和恶性肿瘤中负性调控免疫功能,诱导T细胞“耗竭”及功能紊乱。Tim-3表达阳性的T细胞无法增殖或产生细胞因子,进而导致肿瘤发生免疫耐受和免疫逃逸。tim-3在胶质瘤患者外周血和肿瘤浸润cd4+t及cd8+t细胞表达上调,且高级别胶质瘤患者cd8+t细胞的tim-3表达进一步增加,提示tim-3与胶质瘤的发生发展及免疫逃逸密切相关。癌胚抗原相关细胞黏附分子1(carcinoembryonicantigenrelatedcelladhesionmolecule1,ceacaml)属于癌胚抗原(cea)家族成员之一,广泛表达于上皮细胞和效应性免疫细胞表面,在负性免疫调控的过程中发挥重要作用。ceacam1是tim-3的新型特异性配体,当ceacam1过表达时,可以显著增强tim-3分子的负性免疫调控功能。最新的研究表明,tim-3/ceacam1在恶性肿瘤的发生发展和免疫逃逸中发挥关键的调控作用。因此,本研究以负性免疫检查点分子tim-3/ceacam1为切入点,观察ceacam1分子在胶质瘤中的表达规律,及与胶质瘤临床病理因素的相关性;探讨tim-3信号对胶质瘤恶性生物学行为及t淋巴细胞抗肿瘤免疫特性的影响及其可能机制;分析靶向阻断tim-3/ceacam1信号通路对小鼠颅内胶质瘤生长、抗肿瘤免疫功能重建及免疫记忆功能的影响。以上研究将进一步完善对tim-3/ceacam1这一重要通路功能的认识,揭示其在促进胶质瘤增殖与肿瘤免疫逃逸中的双重促瘤作用及机制,为胶质瘤提供新的治疗策略。本研究将从从临床标本、体外研究和体内研究三个方面深入开展以下探索:1.ceacam1在胶质瘤肿瘤浸润与外周血t淋巴细胞中的表达特征及其临床意义目的:研究ceacam1在胶质瘤患者肿瘤浸润及外周血中cd4+、cd8+t淋巴细胞中的表达情况,分析其与胶质瘤相关临床因素之间的关系。方法:收集病理资料齐全的新鲜胶质瘤组织51例,分离获得肿瘤浸润t淋巴细胞(tumor-infiltratinglymphocytes,tils),同时采集同一患者外周血单核细胞(peripheralbloodmononuclearcells,pbmcs),30例健康志愿者pbmcs作为对照组。经流式细胞仪检测ceacam1在cd4+t、cd8+t淋巴细胞上的表达,通过免疫组化分析胶质瘤组织和正常脑组织(来自严重脑损伤患者减压切除)中ceacam1的表达,探讨ceacam1与胶质瘤病理分级、卡氏评分(kps评分)及血清ifn-γ等多种相关临床病理因素的关系。结果:(1)流式细胞术检测结果提示:与健康对照组相比,胶质瘤患者pbmcs中的cd4+t细胞和cd8+t细胞上ceacam1表达阳性率和平均荧光强度均升高(p<0.001),而在胶质瘤患者tils中ceacam1的表达进一步升高(p<0.001);(2)ceacam1在高级别胶质瘤患者(iii–iv级为1组)pbmcs中t细胞的表达高于低级别患者(i–ii级为1组),在tils中表达进一步升高(p<0.001);(3)ceacam1在胶质瘤患者pbmcs和tils中t淋巴细胞上的表达水平与kps评分呈负相关(p均<0.05)。(4)ceacam1在胶质瘤患者pbmcs和tils中cd4+t淋巴细胞上的表达水平与患者血清ifn-γ水平呈负相关(p<0.05),tils中ceacam1+cd8+t细胞与患者血清ifn-γ水平也呈负相关(p<0.05);(5)免疫组化结果显示:ceacam1在胶质瘤中的表达水平与病理分级呈正相关,在正常脑组织中几乎无表达,同时ceacam1在胶质瘤中的表达与t淋巴细胞中的表达也具有相关性(p<0.05)。2.体外实验探讨tim-3介导胶质瘤免疫逃逸的机制和关键分子目的:研究tim-3通路在胶质瘤免疫逃逸中发挥的作用及机制。方法:首先通过免疫磁珠法富集分离pbmcs中cd8+t淋巴细胞,然后流式细胞法检测cd8+t淋巴细胞的提取纯度。利用il-12上调cd8+t细胞上tim-3的表达水平,利用tim-3单克隆抗体靶向封闭tim-3+cd8+t淋巴细胞上的tim-3分子,分别将体外激活的各组cd8+t淋巴细胞和人脑胶质瘤细胞系u87和u251共培养;通过cfse法观察对cd8+t淋巴细胞增殖的影响;采用realtime-pcr及流式细胞法分别从基因和蛋白水平检测靶向封闭tim-3前后cd8+t细胞ifn-γ分泌能力;cck-8法和流式细胞法观察对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响;采用elisa法观察共培养体系上清液中ifn-γ表达的影响。结果:(1)经过免疫磁珠筛选提纯的cd8+t淋巴细胞纯度均在95%以上,符合实验要求;(2)il-12可以明显上调cd8+t淋巴细胞上tim-3的表达水平,且cd8+t淋巴细胞经不同组合的细胞因子刺激后均表现为细胞体积增大,有明显的细胞集落样增殖,但各组之间细胞形态无明显差异;(3)realtime-pcr及流式细胞法均显示靶向封闭tim-3后,cd8+t淋巴细胞ifn-γ分泌能力明显提高(p<0.001);(4)cfse结果显示靶向封闭tim-3通路,cd8+t淋巴细胞增殖能力提高(p<0.05);(5)靶向封闭tim-3后胶质瘤细胞凋亡增加(p<0.05);(6)封闭tim-3后胶质瘤细胞增殖活力下降(p<0.05);(7)elisa结果显示:封闭tim-3后,共培养体系上清液中ifn-γ表达升高(p<0.05)3.靶向封闭tim-3/ceacam1通路对小鼠颅内胶质瘤生长、免疫功能重建及免疫记忆功能的影响及机制研究。目的:观察靶向封闭tim-3/ceacam1信号对小鼠原位胶质瘤模型颅内肿瘤的生长,小鼠生存期,抗肿瘤免疫效应、功能以及产生免疫记忆杀伤的作用。方法:慢病毒转染法将荧光素酶基因稳定转染入gl261小鼠胶质瘤细胞,通过立体定向技术将胶质瘤细胞种植于c57bl/6小鼠的大脑右侧尾状核,从而构建小鼠原位胶质瘤模型;小动物活体成像系统动态检测小鼠颅内胶质瘤的生长情况,按照瘤体大小将小鼠平均分至anti-tim-3组,anti-ceacam1组,anti-tim-3+anti-ceacam1组及同型对照组;分别给予4组小鼠腹腔注射anti-tim-3、anti-ceacam1,anti-tim-3+anti-ceacam1单抗及同型对照单抗,动态观对小鼠原位胶质瘤的增殖情况,记录各组小鼠的生存期并绘制相应的生存曲线;he染色确定小鼠颅内肿瘤病理形态;流式细胞术观察脑浸润淋巴细胞(braininfiltratinglymphocytes,bils)中cd4+t、cd8+t及cd4+cd25+foxp3+tregs的表达水平;elisa法观察小鼠血清ifn-γ和tgf-β含量;利用抗体清除小鼠体内cd4+t及cd8+t细胞后,再次观察治疗效果;分别对“治愈”小鼠及同龄空白小鼠进行皮下成瘤实验来观察治疗后小鼠的免疫记忆功能。结果:(1)成功构建c57bl/6-gl261小鼠原位胶质瘤模型,成瘤率达80%;(2)对照组、anti-tim-3组,anti-ceacam1组,anti-tim-3+anti-ceacam1组小鼠平均生存期分别为29.8、43.4、42.3及86.0天;(3)anti-tim-3+anti-ceacam1组中80%的小鼠达到长期生存(生存期>90天);(4)靶向封闭tim-3/ceacam1后小鼠bils中cd4+、cd8+t细胞增加,tregs减少(p<0.05);(5)靶向封闭tim-3/ceacam1后小鼠血清ifn-γ和tgf-β水平分别上调及下调(p<0.05);(6)清除小鼠体内cd4+t及cd8+t细胞后,小鼠治疗的生存受益消失;(7)空白小鼠全部成瘤,而长期生存的“治愈”小鼠未见肿瘤形成。结论:(1)ceacam1在胶质瘤患者t淋巴细胞及胶质瘤细胞中的表达异常升高,且与胶质瘤患者多种临床因素密切相关,提示ceacam1参与了胶质瘤的发生发展和免疫逃逸。(2)靶向封闭Tim-3可以逆转CD8+T细胞的无能化,可能是由于提高其增殖率,恢复免疫杀伤效应以及影响相关细胞因子表达实现的。(3)靶向封闭免疫检查点Tim-3/CEACAM1可以显著抑制小鼠原位胶质瘤的增殖,延长小鼠生存期,增强抗肿瘤免疫反应,并产生对肿瘤细胞的免疫记忆。综上所述,免疫检查点分子Tim-3/CEACAM1有望成为胶质瘤免疫治疗新的靶点。