论文部分内容阅读
干旱是当今世界面临的全球性问题,干旱胁迫严重影响植物生长发育,造成农作物减产,并使生态环境日益恶化。植物内源激素脱落酸（ABA）在植物生长发育和抵御环境胁迫过程中扮演着非常重要的角色。已有的报道证明在干旱缺水时,ABA调控植物气孔关闭来降低蒸腾作用,阻碍水分丧失。同时,微丝骨架参与调控气孔的开闭,其动态的紊乱会造成气孔不能正常开闭,微丝骨架构象的转换也影响了气孔的开闭速度。然而微丝骨架的动态变化是否参与响应ABA信号还未见报道。此外,微丝结合蛋白（Actin binding protein,ABP）-凝溶胶蛋白超家族（Villin/gelsolin/fragmin super family）成员是一类钙离子依赖的微丝结合蛋白,一般含有3个或6个gelsolin结构域（gelsolin-like domain,简称G区）,并且每个结构域的功能各有不同。经过30多年的研究,大多数G区的功能已被鉴定,但是G3区的功能仍不清楚。本文对拟南芥ADF5响应干旱胁迫的作用机制及凝溶胶蛋白超家族G3区的功能进行了研究,并取得如下结果:1、发现ADF5负调控ABA介导的种子萌发及子叶绿化。研究表明干旱和ABA处理均可诱导ADF5上调表达,暗示ADF5参与响应干旱胁迫;ADF5的功能缺失突变体adf5的种子萌发及子叶绿化过程对外源ABA不敏感,证明ADF5负调控ABA介导的种子萌发及子叶绿化。2、揭示了ADF5通过调节气孔的闭合来响应植物干旱胁迫。土壤干旱实验证明,adf5植株的萎蔫程度及死亡率均高于WT（Wild type）,呈现干旱敏感表型;离体叶片失水分析发现,adf5突变体失水率显著高于WT;气孔开度实验表明,在响应干旱/ABA诱导的气孔闭合时,adf5突变体气孔的闭合速率显著慢于WT,不能正常闭合。上述实验结果说明,ADF5通过调节气孔的闭合来响应植物干旱胁迫。3、阐释了ADF5特异地参与ABA介导的种子萌发、子叶绿化及干旱响应,而ADF9并不参与这些生理过程。拟南芥ADF第三亚家族包含ADF5和ADF9,种子萌发、子叶绿化及干旱失水实验证明,ADF9的功能缺失突变体adf9与WT具有相同的萌发率、子叶绿化率及离体叶片失水率,并且adf5×adf9与adf5也具有相同的种子萌发率、子叶绿化率及离体叶片失水率,说明ADF5特异地参与ABA介导的种子萌发、子叶绿化及干旱响应。4、发现ADF5通过调控微丝骨架的构象变化来介导气孔的闭合。通过观察活细胞中的微丝结构发现,adf5突变体保卫细胞中的微丝含量及微丝束化程度都显著降低,微丝动态和排布转换产生延迟,表明ADF5可能通过调控微丝的构象变化来调控气孔的闭合。5、揭示了ADF5的上调表达受到DPBF3的调控进而响应ABA信号来适应干旱胁迫。ADF5启动子序列分析发现,其启动子区域含有多个ABRE核心结合序列ACGT;ABF/AREBs家族成员缺失突变中ADF5的表达量分析发现,只有在DPBF3的功能缺失突变体dpbf3中ABA不能诱导ADF5的上调表达;酵母单杂交实验证明DPBF3与ADF5启动子含有ACGT顺式作用元件的序列结合;染色质免疫共沉淀分析与转录激活分析证明了DPBF3在体内与ADF5启动子结合并促进其转录激活。上述实验证明,ABA处理时ADF5的上调表达受到DPBF3的调控。6、发现DPBF3通过调控气孔的闭合响应干旱胁迫。离体叶片失水分析表明,dpbf3突变体的失水率显著高于WT;气孔开度实验表明,dpbf3突变体气孔闭合速率慢于WT,表明DPBF3可能通过调控气孔的闭合响应干旱失水。7、阐释了G3区的主要功能是调节Villin/gelsolin/fragmin超家族蛋白活性来调控微丝骨架的动态变化。通过比较ABP135G1-G3（含有百合ABP135蛋白的G1-G3结构域）和ABP29（只含有G1和G2区）体外生化特性发现,在高浓度Ca2+条件下(如10μM和200μM Ca2+),ABP135G1-G3相对于ABP29表现出更高的微丝剪切/解聚活性和肌动蛋白成核能力;在低浓度Ca2+条件下(如41 nM Ca2+时),ABP29比ABP135G1-G3具有更强的微丝封端能力和肌动蛋白成核能力;在稀释解聚过程中,ABP135G1-G3与ABP29表现相互拮抗的生化特性,ABP135G1-G3促进稀释介导的微丝解聚,而ABP29抑制稀释介导的微丝解聚。上述实验结果说明,G3区在Villin/gelsolin/fragmin超家族蛋白活性调控方面发挥重要作用。综上所述,干旱/ABA信号通过ABF/AREB类转录因子DPBF3调控微丝解聚因子ADF5的表达,进而影响微丝骨架的动态与重排来响应植物干旱胁迫。此外,本论文首次揭示了G3区在调节Villin/gelsolin/fragmin超家族蛋白活性方面的重要作用。本文的研究成果丰富了植物耐旱的调控机理,将为提高植物水分利用效率及发展耐旱农业提供新的耐旱基因资源。