中文摘要Ⅰ补体膜调节蛋白抗动脉粥样硬化作用的实验研究背景补体系统的可溶性成分多以前体的形式存在于外周血,当病原入侵或者组织损伤时,可通过经典途径、凝集素激活途径或替代途径被激活。激活的补体系统通过释放白细胞趋化因子C3a和C5a促进炎症反应,并可通过合成膜攻击复合体介导细胞损伤。为了防止自体细胞受到补体系统的攻击,生物体内的多种细胞,尤其是那些接触血液循环的血细胞和内皮细胞,表达了多种结合于细胞膜的补体调节蛋白,其中包括通过GPI结构与细胞膜锚链的CD55和CD59。CD55可以通过促进C3和C5转化酶的降解而调控补体激活,而CD59主要通过抑制膜攻击复合体的形成而发挥作用。近年的研究表明,动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是一种发生于动脉血管壁的慢性炎症,天然性与获得性免疫系统的多个成分参与了其发生发展过程。作为天然性免疫系统的一个重要组成部分,补体系统致AS的作用已为许多研究所揭示。各种补体系统的激活产物,调节蛋白和补体受体均可在AS病灶,尤其是易损斑块和已破裂斑块中被探及,并且对人体病变的研究发现,膜攻击复合体的沉积量与病灶进展程度呈现正相关。对补体敲基因动物的研究亦初步揭示了补体致AS的机理:补体激活的中心分子—C3的基因缺陷可以通过上调血甘油三酯的浓度促进AS病灶的发展;C6基因缺陷可以明显减少高胆固醇饮食所诱发的兔主AS,而C5基因敲除却并没有明显地影响ApoE^-/-小鼠的斑块大小,意味着补体终末效应物-膜攻击复合体在AS发展的过程中发挥着较为复杂的作用;在补体激活通路的研究方面,替代激活途径的关键因子-Factor B缺陷并没有对AS产生明显的影响,提示另外两条通路可能发挥着更为重要的作用;而经典激活途径的关键因子-Clq基因缺陷却通过影响坏死细胞的清除促进了病变的发展。总之,近来的研究表明,补体系统参与了AS的发病过程,但是其具体的作用机制十分复杂,仍然需要进一步的研究来加以阐明。作为补体系统的重要组成部分,膜调节蛋白亦被发现存在于AS病灶中,并且研究发现,阿托伐他汀和C反应蛋白均可诱导内皮细胞表达补体膜调节蛋白,从而使之幸免于补体系统的裂解作用。补体膜调节蛋白是否参与了AS病灶的发生和发展过程,具体的作用机制是什么,目前均无研究加以阐明。由于该组蛋白具有明显的补体激活抑制作用,我们提出如下科学假说:补体膜调节蛋白通过抑制补体激活或补体效应物的产生而发挥了抗AS作用。目的1.通过分别把CD55^-/-和CD59^-/-小鼠与ApoE^-/-小鼠杂交,获得易形成AS斑块的双基因敲除小鼠;2.通过对双敲小鼠的病变范围、斑块大小和病灶内容物进行分析,研究补体膜调节蛋白-CD55和CD59在AS发生发展中的作用;3.通过对血脂、血尿、补体激活和T细胞免疫的分析,探讨CD55和CD59抗AS的机制。方法1.获取双基因敲除小鼠及高脂喂养把CD55^-/-小鼠与ApoE^-/-小鼠杂交,获得CD55^+/+ApoE^-/-杂合子,以杂合子小鼠交配繁殖获得CD55^-/-ApoE^-/-小鼠和同龄野生型对照-CD55^+/+ApoE^-/-小鼠。将6周龄的小鼠根据高脂喂养时间和性别分为4组:短期雌性组包括雌性CD55^-/-ApoE^-/-小鼠和雌性CD55^+/+ApoE^-/-对照,高脂喂养8周;短期雄性组包括雄性CD55^-/-ApoE^-/-小鼠和雄性CD55^+/+ApoE^-/-对照,高脂喂养8周;长期雌性组包括雌性CD55^-/-ApoE^-/-小鼠和雌性CD55^+/+ApoE^-/-对照,高脂喂养16周;长期雄性组包括雄性CD55^-/-ApoE^-/-小鼠和雄性CD55^+/+ApoE^-/-对照,高脂喂养16周。以与CD55同样的方式,把CD59^-/-小鼠与ApoE^-/-小鼠杂交,获得获得CD59^-/-ApoE^-/-和CD59^+/+ApoE^-/-小鼠。将6周龄的CD59^-/-ApoE^-/-和CD59^+/+ApoE^-/-小鼠按照高脂喂养时间和性别分为4组。各组高脂喂养结束后,小鼠空腹过夜后被处死。自下腔静脉收集血液标本,并冻存。PBS冲洗左侧心腔及动脉腔内的残血后,将心脏分离并包埋于OCT。钝性分离自主动脉弓到腹主动脉分叉处的主动脉节段,进行染色分析。所有的动物实验及相关处理均通过了美国宾夕法尼亚大学动物管理及应用委员会的批准。2.血液及尿液分析应用酶法测定血清总胆固醇水平。应用代谢笼连续24小时收集小鼠的尿液,并应用HPLC/MS/MS法分析尿液中脂质代谢产物8,12-iso-iPF2_α-V和肌酐的水平。3.斑块大小分析将主动脉纵剖后钉于蜡版,并进行苏丹Ⅳ染色分析。病变范围表示为AS斑块占主动脉表面积的百分比。将小鼠心脏进行6μm连续冰冻切片,收集自出现三个主动脉瓣叶起至瓣尖的切片。对冰冻切片进行油红0染色,照相并应用软件分析。斑块大小表示为斑块占主动脉根面积的百分比。4.病理学检测对主动脉窦部冰冻切片行免疫组化染色和天狼星红染色,测量斑块内平滑肌细胞、巨噬细胞、C3、C9和胶原的阳性染色面积,其含量表示为阳性染色面积占斑块总面积的百分比。对切片行CD4和CD8免疫组化染色,计数单位面积内的阳性细胞个数。5.统计学分析定量数据均以均数±标准误表示,应用Graphpad公司的Prism3.0进行统计分析。在做分析之前,对所有的数据进行正态分布检验。对于正态分布的数据应用双侧t检验,对非正态分布的数据应用Mann—Whiteney分析。设P＜0.05为有统计学意义。结果1.CD59的抗AS作用短期雌性组内,虽然主动脉表面病灶范围并无组间差异（2.07±0.27%vs.1.34±0.21%,P=0.06）,但是CD59^-/-ApoE^-/-小鼠主动脉窦部的斑块明显大于CD59^+/+ApoE^-/-对照（20.74±1.33%vs.13.12±1.46%;P＜0.005）。然而,短期雄性组内,雄性CD59^-/-ApoE^-/-小鼠与CD59^+/++ApoE^-/-对照间未发现显著差异（病变范围:1.35±0.16%vs.1.57±0.19%,P=0.3936;斑块大小:11.23±1.23%vs.12.75±1.41%,P=0.536）。长期雌性组内,CD59基因缺陷明显地增加了雌性小鼠的病变覆盖范围（17.13±1.14%vs.9.72±1.14%;P＜0.001）,但是却未对主动脉窦部的斑块大小产生明显的影响（32.67±1.58%vs.34.44±2.52%;P=0.315）。与短期雄性组的结果相似,在长期雄性组内未发现显著差异（病变范围:12.88±1.49%vs.10.98±0.95%,P=0.779;斑块大小:26.84±1.97%vs.29.46±2.3%,P=0.408）。CD59基因缺陷导致了病变覆盖范围的扩大或局部斑块的增大,提示CD59具有明显的抗AS作用。然而,无论是在短期还是长期雄性组内,均未发现显著的差异,提示CD59的抗AS作用存在明显的性别差异。2 CD55缺陷与AS与CD59基因缺陷的结果不同,无论在雄性还是雌性组,CD55基因敲除均未引起明显的病变范围或斑块大小的改变。在短期雌性组,雌性CD55^-/-ApoE^-/-和CD55^+/+ApoE^-/-小鼠的病变范围（0.80±0.17%vs 1.37±0.22%;P=0.07）和斑块大小（21.45±1.33%vs 23.58±2.1096;P=0.337）无显著差异:同样的结果也见于短期雄性组（病变范围:1.14±0.17%vs 0.80±0.14%,P=0.207:斑块大小:15.68±1.58%vs 16.89±1.65%,P=0.921）。在长期雌性组,CD55^-/-ApoE^-/-与CD55^+/+ApoE^-/-小鼠的病变范围（6.39±0.59%vs 5.81±0.51%:P=0.303）和斑块大小（29.81±2.78%vs 29.11±3.25%;P=0.918）无显著差异;长期雄性组内,也未发现明显的差异（病变范围:6.09±0.83%vs 6.16±0.69%,P=0.95;斑块大小:25.25±3.02%vs 30.94±3.22%;P=0.281）。3 CD59缺陷对斑块构成的影响通过对短期雌性组的病理学分析,我们研究了CD59基因缺陷对斑块内各种成份的影响。CD68染色显示,CD59^-/-ApoE^-/-和CD59^+/+ApoE^-/-小鼠巨噬细胞的分布和相对含量较为一致（18.74±2.79%vs.18.66±2.41%;P=0.983）,提示CD59并没有参与巨噬细胞的粘附、浸润或增殖过程,仅仅通过其他途径促进了斑块的发展,而巨噬细胞呈现等比例的增加;α-SMC actin染色显示,CD59^-/-ApoE^-/-小鼠的平滑肌细胞显著少于对照组（3.69±0.51%vs.6.42±0.86%;P＜0.05）;苦味酸-天狼星红染色发现,CD59基因缺陷小鼠的胶原含量较对照小鼠明显增加（8.14±0.33%vs.6.07±0.82%:P＜0.05）。2.4 CD59抗AS作用的机制血清学分析显示,短期雌性组内,CD59^-/-ApoE^-/-小鼠的血清总胆固醇显著高于CD59^+/+ApoE^-/-小鼠（1404±43.74vs.1208±57.78mg/dL;P＜0.05）,提示CD59可能通过降低血清总胆固醇发挥抗AS作用。通过对尿液中氧化应激标志物的质谱分析,发现在雌性CD59^-/-ApoE^-/-小鼠和CD59^+/+ApoE^-/-对照间无显著差异（短期雌性组:2.98±1.01 vs.3.12±0.96 ng/mg肌酐,P=0.92;长期雌性组:1.65±0.56 vs.1.59±0.38 ng/mg肌酐,P=0.92）,因而CD59基因缺陷并未对该系统产生显著的影响。短期雌性组的C3免疫组化染色发现,CD59^-/-ApoE^-/-小鼠与对照小鼠间斑块内的C3沉积无显著差异（28.65±1.69%vs.25.33±3.07%,P=0.37）,提示CD59基因缺陷并没有影响局部的补体激活;而C9染色发现,CD59^-/-ApoE^-/-小鼠斑块内的C9沉积明显多于对照组（17.32±1.52%vs.8.74±3.63%,p＜0.05）,提示CD59基因缺陷时,局部的补体膜攻击复合体形成明显增加。为了明确CD59是否通过影响T细胞而发挥抗AS作用,对短期雌性组的小鼠切片做了CD4和CD8染色分析。结果发现,CD59^-/-ApoE^-/-和CD59^+/+ApoE^-/-小鼠斑块内的T细胞含量无差异（CD4⁺T细胞:35.89±8.505 vs.40.99±7.091/mm²,P=0.66:CD8⁺T细胞:1.622±1.622 vs.5.384±3.946/mm²,P=0.40）。结论1 CD59可能通过降低血清总胆固醇和减少补体效应产物-膜攻击复合体的生成而发挥抗AS的作用。该作用与氧化应激和GPI介导的T细胞激活无明显的相关性。CD59的抗AS作用仅见于雌性,具有明显的性别差异。2 CD59并没有参与斑块内巨噬细胞的粘附、迁移和增殖过程,该因子缺陷时通过影响其他方面导致了等幅度的巨噬细胞浸润;CD59通过抑制膜攻击复合体的形成保护血管壁平滑肌细胞免受补体系统的攻击。3 CD55基因缺陷并没有引起明显的斑块大小改变,提示在动脉壁保护的过程中,其他的C3转化酶抑制剂如Factor H和Crry可能发挥着更重要的作用。在CD55基因缺陷的情况下,C3转化酶的功能仍然得到了有效的抑制,补体系统并未被有效地激活。4主动脉表面的病变范围和窦部的斑块大小存在失偶联的现象,很可能是由于根部的空间有限,在ApoE缺陷较强的致AS背景下,其他基因很难引起明显的斑块大小改变。主动脉表面具有广阔的空间,可以作为更恒定的评价指标。中文摘要Ⅱ补体过敏毒素调节Toll样受体致炎作用的体外研究背景天然免疫系统是机体抵御病原微生物感染的第一道防线。Toll样受体（tolllike receptors,TLRs）和补体是天然免疫系统的两个重要组成部分,通过迅速诱发炎症反应和激活继发的获得性免疫而在应对致病原的过程中发挥着重要的作用。哺乳动物的TLRs,是果蝇Toll样蛋白的同源体,属于病原模式识别受体家族,可以通过识别病原或坏死细胞的相关分子活化天然免疫系统,同时也可以通过向抗原递呈细胞提供信号而启动获得性免疫系统,在细胞吞噬的调节、炎症反应的激活等方面发挥着重要的作用。补体是由30余种可溶性蛋白和膜结合性蛋白组成的多分子系统。其可溶性成分多以无活性的前体形式存在于血液循环中,需要时,在激活物如抗原-抗体复合物等的作用下,被依次激活,形成膜攻击复合体,发挥溶解、破坏细菌、病毒等致病微生物的作用。除膜攻击复合体外,补体系统激活时尚可以通过产生过敏毒素-C3a和C5a,参与机体的抗感染免疫,扩大体液免疫效应,调节免疫应答。研究发现,许多TLRs的天然激活物如革兰阴性菌来源的脂多糖和来源于酵母细胞壁的酵母多糖也可以激活补体系统,提示在这两系统间可能存在一定的相互联系。探讨补体和TLRs之间是否存在相互作用及其具体的作用机制,对于深入理解炎症和机体的免疫反应具有极其重要的意义。日前,我们的一项研究发现,LPS等TLRs激活剂在CD55^-/-小鼠诱发的炎症反应明显强于对照小鼠,提示补体上调了TLRs的致炎作用。后继的机制研究发现,该作用是由补体过敏毒素-C3a和C5a所介导的。体内实验中,补体与TLRs的协同作用发生迅速,TLRs激活剂注入体内后3小时即达到顶峰,提示该作用很可能是由与循环系统密切接触的器官或者组织所介导的。内皮细胞构成了机体内最大的“内分泌器官”,并且与循环系统直接接触,故而我们提出如下科学假说:内皮细胞介导了补体对TLRs致炎作用的调节。在本研究中,我们应用人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和小鼠心脏内皮细胞（H5V）对内皮系统在这一过程中的作用进行了探讨。目的研究内皮细胞是否介导了补体C3a和C5a对TLRs致炎作用的调控,并探讨其具体的作用机制。方法1细胞及其培养人脐静脉内皮细胞,培养于含10%胎牛血清、0.05 mg/ml内皮细胞生长因子、2mML—谷氨酰胺、0.1mg/ml肝素和100 U混合抗生素的以M199为主体的培养基中。H5V为来源于小鼠心脏的内皮细胞系,培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基内。内皮细胞贴壁生长于以0.1%明胶预先包被的培养皿中,37℃、5%CO₂的条件下,2-3天传代一次。其中第5-7代的HUVEC用于实验。2细胞毒性实验以单剂细胞增殖分析法研究C3a、C5a、Pam3CKS4、Poly I:C、LPS和CPG对内皮细胞的毒性作用,以选出可用的浓度范围。3内皮细胞C5a受体的测定以流式细胞仪分析HUVEC和H5V表面的C5a受体的表达情况,以确认内皮细胞可表达C5aR。4干预实验以1×10⁵个/孔的浓度将细胞接种于24孔板,培养24小时后细胞大约融合至80%。在分析浓度-效应时,将各TLRs激活剂以培养基梯度稀释成5个浓度,刺激24小时;在分析时间-效应时,以选定的浓度稀释TLRs激活剂,分别刺激内皮细胞3、6、9、12、15和24个小时。刺激实验结束后,收集培养液用于IL-6或IL-8的ELISA分析,以选出合适的作用浓度和时间。过敏毒素和TLRs激活剂联合作用时,用不同浓度的C3a和C5a合并选定浓度的TLRs激活剂刺激80%融合的单层内皮细胞24小时。取培养液用于IL-6、IL-8或chemokines KC的ELISA分析,研究过敏毒素是否上调了TLRs的致炎作用。5酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunoad sorbent assay,ELISA）按照生产厂家提供的实验步骤,对稀释过的培养液进行IL-6、IL-8或chemokine KC的ELISA分析。结果1细胞毒性实验应用单剂细胞增殖分析试剂盒,检测了补体过敏毒素和TLRs对H5V的细胞毒性作用。结果显示,C3a在0-100nM,C5a在0-200nM,Pam3CKS4在0-10000 ng/ml,PolyI:C在0-50μg/ml,LPS在0-1000 ng/ml,CPG在0-160ng/ml为安全的浓度区域,并未引起明显的细胞坏死。2 C5a受体表达应用流式分析,发现在HUVEC和H5V表面有相当数量的C5aR表达,而同时染色的阴性对照-HEK细胞上几乎没有荧光信号。3 C5a和C3a对TLR4致炎作用的影响LPS浓度-效应的分析发现,10ng/ml LPS即可以明显地增加H5V细胞的IL-6表达,随后IL-6的生成随着LPS浓度的增高而增加,当LPS浓度为500ng/ml时达到顶峰;时间-效应的分析发现,100ng/ml LPS作用3小时即可以诱导H5V细胞IL-6的释放增加,其效应随着作用时间的延长而增加,在刺激24小时时达到顶峰。根据上述实验结果,我们选用10 ng/ml和100 ng/ml作为LPS的作用浓度,与C3a和C5a联合作用于内皮细胞。刺激24小时后,100 ng/ml的LPS明显地增加了IL-6的生成,其作用约为10 ng/ml组的2.7倍。但无论是合并10 ng/ml还是100 ng/ml的LPS,50nM C3a或C5a均未显著地增加LPS的诱导IL-6或chemokine KC的生成。应用不同浓度的C5a与100 ng/ml LPS同时刺激H5V,结果在其他浓度时,并未发现明显的上调作用。应用HUVEC重复了上述实验,也只获得了类似的结果。4 C3a和C5a对其他补体激活物致炎作用的影响100ng/ml Pam3CSK 4即可引起明显的IL-6表达增加,其刺激作用在1000ng/ml时达到最高;IL-6的生成亦随着Pam3CSK 4作用时间的延长而增加,刺激24小时达到顶峰。联合刺激时,100ng/ml Pam3CSK 4明显增加了内皮细胞的IL-6生成,但50hM C3a或50nM C5a均未对Pam3CSK4的致炎作用产生明显影响。1μg/ml PolyI:C即可引起明显IL-6表达增加,其刺激作用在50μg/ml时达到最高:IL-6的生成随着作用时间的延长而增加,刺激24小时达到顶峰。联合刺激时,1μg/mlPolyI:C明显增加了内皮细胞的IL-6表达,但50hM C3a或50nM C5a均未对PolyI:C的致炎作用产生明显影响。分析CPG的浓度-效应时,先后分析了5个浓度:200ng/ml、2μg/ml、20μg/ml、100μg/ml和200μg/ml,均没有引起明显的IL-6表达增加;时间-效应分析发现,20μg/mlCPG刺激24小时后,未引起明显的IL-6表达增加。合并50nM C3a或C5a时,20μg/mlCPG对内皮细胞刺激24小时,未发现明显的IL-6和chemokine KC表达增加。应用HUVEC替代H5V后,发现了Pam3CSK4和Poly I:C可以明显地诱导IL-8表达,但并未发现C3a和C5a可以上调TLRs激活物的致炎作用。结论1 Pam3CSK4、Poly I:C和LPS可以激活相应的TLRs,引起明显的炎性细胞因子释放。心脏内皮细胞也具有与人脐静脉内皮细胞相似的反应性,可以在Pam3CSK4、Poly I:C或LPS的刺激下,产生大量的炎性因子。2无论是HUVEC还是H5V,过敏毒素-C3a或C5a的联合刺激均未显著地增加TLRs的致炎作用,提示内皮细胞并未参与补体上调TLRs致炎作用这一过程。