CD4+T细胞是适应性免疫系统中关键的免疫细胞。正常情况下,它可以识别抗原提呈细胞（APC）提呈的抗原,通过分泌细胞因子,增强巨噬细胞的活性,促进B细胞活化产生抗体,共同对抗各种病原微生物入侵。另外,它可以识别自身抗原,诱导机体免疫耐受,防止自身免疫疾病的出现。因此,T细胞活化一旦失调,会导致严重的免疫缺陷或自身免疫疾病。T细胞的活化需双重信号共同作用。第一信号为APC摄取加工的MHC-抗原肽提呈给T细胞表面的TCR-CD3复合体,招募ZAP70并活化下游LAT的信号复合体,激活多种信号通路,如PLCγ1-PKCθ-NF-κB通路、RAS-RAF-MEK-ERK通路以及Ca2+通路。第二信号最主要的是共刺激分子CD28,它与APC膜上分子B7相互作用,可以激活AKT信号通路,最终促进T细胞增殖和细胞因子产生。RAF-1在RAS介导的T细胞增殖活化信号通路中极为重要,静息状态下是自抑制结构,被RAS招募到膜上才开始活化。对RAF-1的调控,多集中在磷酸化修饰上。而泛素化修饰和O-糖基化修饰参与调控了 RAF-1蛋白的稳定性,是否还有其它泛素化修饰以非降解蛋白的方式调控RAF-1活化仍然未知。本研究发现,E3泛素连接酶TRIM31促进RAF-1的K327和K493位点K33位连接的多聚泛素化修饰,抑制其与细胞内膜上的RAS结合,最终抑制其活化。CD4+ T细胞中TRIM31缺失可以明显的促进RAF-1和ERK的磷酸化,细胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α的产生明显增多,T细胞表面活化的标志CD69和CD25表达明显增强,细胞增殖也明显加快。在小鼠体内,TRIM31缺失促进了 CD4+T细胞的活化和Th1细胞的极化。与野生型小鼠相比,Trim31fl/flCd4Cre小鼠对实验性变态反应性脑脊髓炎（EAE）更易感,但也能够抑制B16黑色素瘤的发生发展。一、研究目的1.明确TRIM31在CD4+T细胞活化中的作用,并探究具体的分子机制;2.通过小鼠EAE模型和B16黑色素瘤模型,确定TRIM31在体内调控CD4+T细胞活化及免疫应答的作用。二、研究方法1.检测在T细胞活化中TRIM31蛋白的变化通过磁珠分选,获取野生型小鼠的CD4+T细胞,使用CD3（5 μg/ml）和CD28（1μg/ml）抗体处理,检测不同时间点TRIM31的蛋白表达。2.检测TRIM31调控CD4+T细胞增殖和活化2.1 TRIM31对CD4+T细胞增殖的影响分选获取Trim31fl/fl和Trim31fl/flCd4Cre小鼠的CD4+T细胞,加入CFSE,孵育5min,使用anti-CD3+anti-CD28处理,流式细胞术检测48h、72h的CFSElow细胞群的比例。2.2 TRIM31 对 IL-2、IFN-γ和 TNF-α 表达的影响分选获取Trim31fl/fl和Trim31fl/flCd4Cre小鼠的CD4+T细胞,使用anti-CD3+anti-CD28处理,或单独使用anti-CD3处理,收取0、24、48、72h的培养液上清,ELISA法检测生长因子IL-2的分泌。qRT-PCR法测定Il-2、Ifng和Tnfa mRNA的表达水平。2.3 TRIM31对CD4+T细胞表面分子CD69和CD25的影响分选获取Trim31fl/fl和Trim31fl/flCd4Cre小鼠 CD4+T 细胞,使用 anti-CD3+anti-CD28处理不同时间,流式细胞术检测细胞表面CD69、CD25的表达。2.4回补TRIM31检测CD4+T细胞中IL-2和IFN-γ分泌水平的变化分选获取Trim31fl/fl和Tm31fl/flCd4Cre小鼠的CD4+T细胞,活化24h后,加入小鼠的TRIM31野生型或E3泛素连接酶活性突变的TRIM31（C52A,C55A）慢病毒感染48 h,使用CD3和CD28的抗体处理72 h,取培养上清,ELISA法测细胞因子IL-2和IFN-γ的表达。3.TRIM31对TCR信号通路的影响分选获取Trim31fl/fl和Trim31fl/flCd4Cre小鼠CD4+T细胞,使用anti-CD3+anti-CD28处理不同时间,Western blot检测TCR通路上游分子ZAP70、PLCγ1,下游分子RAF-1、NF-κB、MAPK的磷酸化情况。4.筛选TRIM31的作用靶点构建RAS-RAF-MEK-ERK信号通路上重要分子RAS、RAF-1、MEK1（MAP2K1）、MEK2（MAP2K2）、ERK1（MAPK3）、ERK2（MAPK1）的过表达载体,与GFP-TRIM31共同转染入HEK293T细胞,Co-IP检测与TRIM31相互作用的分子。5.TRIM31与RAF-1的结合实验5.1免疫荧光检测两者的共定位将GFP-TRIM31和Myc-RAF-1共同转染入HEK293T细胞,24 h后,免疫荧光染色,使用共聚焦显微镜观察这两者的共定位情况。5.2体外直接结合的检测利用体外翻译系统获得Flag-TRIM31和Myc-RAF-1的重组蛋白,共同孵育后,加入TRIM31抗体,Co-IP检测两者的直接结合作用。5.3 CD4+T细胞中内源结合的检测分选获取Trim31fl/fl和Trim31fl/flCd4Cre小鼠 CD4+T 细胞,使用 anti-CD3+anti-CD28处理0、5、15、30 min,分别加入TRIM31或IgG的抗体,Co-IP检测内源TRIM31与RAF-1的结合。5.4结构域结合的检测分别使用Flag-TRIM31的截短突变体与Myc-RAF-1或Myc-RAF-1的截短突变体与GFP-TRIM31共同转染入HEK293T细胞,使用Flag或Myc抗体做IP,Western blot测定两者之间能够发生相互作用的关键区域。6.检测TRIM31对RAF-1的泛素化修饰6.1过表达实验测TRIM31对RAF-1的修饰在 HEK293T 细胞中,共转染 Myc-RAF-1、HA-Ubiquitin、Flag-TRIM3 1 或者泛素连接酶活性突变体Flag-TRIM31（C53A,C56A）,加入anti-Myc的抗体,Co-IP检测TRIM31对RAF-1的泛素化水平的影响。同样的方法,将过表达载体Myc-CD3ζ、Myc-ZAP70、Myc-LAT以及RAS-RAF-ERK 通路上的 Myc-RAS、Myc-MAP2K1、Myc-MAP2K2、Myc-MAPK3 和Myc-MAPK1 与 HA-Ubiquitin、Flag-TRIM31 共同转染,加入 anti-Myc 抗体,Western blot检测TRIM31对上述T细胞信号通路重要分子的泛素化。将带有 Flag 标签的 TRIM 10、TRIM15、TRIM25、TRIM26、TRIM27、TRIM31、TRIM40、TRIM56、TRIM62 或 HA 标签 TRIM14、TRIM30α、TRIM38、TRIM39、TRIM41、TRIM65 和 Myc-RAF-1 及 HA-Ubiquitin 或 V5-Ubiquitin 分别转染HEK293T,加入 anti-Myc 抗体做 IP,Western blot 分析这些 TRIM 分子对 Myc-RAF-1的泛素化,明确其他TRIM分子对RAF-1的泛素化。6.2内源泛素化修饰的检测分选获取Trim3和1fl/fl和Trim31fl/flCd4re小鼠 CD4+T 细胞,使用 anti-CD3+anti-CD28 处理 0、20 min,然后使用 anti-RAF-1 的抗体做 IP,Western blot 检测 TRIM31缺失后,RAF-1内源性泛素化（P4D1）的变化。6.3泛素化类型的检测将Flag-TRIM31、Myc-RAF-1以及不同位点突变的泛素过表达载体HA-Ubiquitin共同转染入HEK293T细胞,蛋白裂解液中加Myc抗体做IP,Western blot测定RAF-1各种类型的泛素化变化水平。利用体外翻译试剂盒,翻译出Myc-RAF-1和Flag-TRIM31蛋白。根据体外泛素修饰系统的体系,再加入E1激活酶、UbcH5a和不同形式的泛素蛋白（WT、K33、K48）及Mg2+-ATP反应,Western blot法测体外蛋白Myc-RAF-1的泛素化修饰形式。6.4鉴定泛素化修饰的位点在 HEK293T 中,共转染入 Flag-TRIM31、Myc-RAF-1 和 HA-Ubiquitin 过表达载体,获取IP后的蛋白,考马斯亮蓝染色电泳后的凝胶,获取目的条带,使用质谱分析检测RAF-1被TRIM31泛素化修饰的潜在位点。然后构建相应的Myc-RAF-1 赖氨酸位点突变为精氨酸的单点突变或多点突变的过表达载体,与 Flag-TRIM31、HA-Ubiquitin（K33）共同转染入 HEK293T,使用 anti-Myc 抗体做 IP,Western blot检测TRIM31对赖氨酸突变的Myc-RAF-1的泛素化修饰的影响,确定RAF-1被修饰的赖氨酸位点。7.检测TRIM31对RAF-1活化的影响7.1检测T细胞中RAF-1与RAS的结合分选获取Trim31fl/fl和Trim31fl/flCd4Cre小鼠CD4+T细胞,使用anti-CD3+anti-CD28处理0、5、15 min,然后使用anti-RAF-1的抗体做IP,WB检测TRIM31对RAF-1与RAS的结合的影响。同样的处理,使用免疫荧光染色技术,共聚焦检测TRIM31对RAF-1与RAS的结合的影响。7.2检测TRIM31对RAF-1与RAS外源结合的影响HEK293T 细胞中共同转入 Myc-RAS、HA-RAF-1、Flag-TRIM3 1 或点突变Flag-TRIM31（C53A,C56A）,加入 anti-Myc 的抗体做 IP,WB 检测 TRIM31 或点突变对与Myc-RAS与RAF-1结合的影响。同样的方法,共同转染 Myc-RAS、Flag-TRIM31、HA-RAF-1 或者 RAF-1（K327R,K493R）,加入 anti-Myc 的抗体做 IP,WB 检测 TRIM31 对 Myc-RAS与 HA-RAF-1 或 RAF-1（K327R,K493R）结合的影响。8.TRIM31在EAE动物模型中的作用分别取6-7周龄的Trim31fl/fl和Trim31fl/flCd4Cre雌性小鼠,皮下注射制备好的含MOG35-55蛋白与完全弗氏佐剂的抗原200 μl（MOG浓度为1mg/ml）,同时分别在0h、48h腹腔注射百日咳毒素200 μl（1μg/ml）,每日观测小鼠并记录临床评分;取抗原免疫20 d小鼠,对脊髓切片做HE和LFB染色;ELISA法测血清中IFN-γ和IL-17A的分泌水平;获取并研磨小鼠大脑组织,在单细胞悬液中加入抗体,使用流式细胞术测定浸润CD4+T细胞及INF-γ+CD4+T和IL-17A+CD4+T细胞的变化;同时获取脾脏和淋巴结的单细胞悬液,流式细胞术检测CD4+T细胞的活化（CD62LloCD44hi）及CD4+T细胞亚群的极化。9.TRIM31在B16小鼠成瘤模型中的作用分别取8周龄的Trim31fl/fl和Trim31fl/flCd4Cre雄性小鼠,右腋窝皮下注射稳转荧光素酶的B16细胞1×106个/只,每日观测小鼠并分别在第7d、11d、15d、19 d尾静脉注射D-荧光素钾盐200μl（15 mg/ml）,小动物活体成像系统记录瘤体生物发光情况;取血清,检测小鼠IFN-γ和IL-17A的分泌水平;取小鼠瘤体、淋巴结和脾脏,使用流式细胞术测T细胞亚群的极化。三、实验结果1.CD4+T细胞活化过程TRIM31表达上调有研究显示,TRIM31在CD4+T细胞中表达高于CD8+T,并且在活化之后的T细胞中表达更高。为了验证这个结论,我们分选了野生型小鼠的CD4+T细胞,加入CD3和CD28的抗体,刺激T细胞活化,结果发现TRIM31蛋白在CD4+T细胞活化过程中表达升高。2.TRIM31抑制CD4+T细胞的增殖和活化为了明确TRIM31是否参与调控CD4+T细胞的活化,我们分选了Trim31fl/fl和Trim31fl/flCd4Cre小鼠的CD4+T细胞,标记CFSE荧光,加入anti-CD3和anti-CD28的抗体处理0、48、72h,流式细胞术结果显示,TRIM31缺失小鼠的CD4+T细胞增殖加快。细胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α是T细胞活化后的产物,我们使用anti-CD3和anti-CD28的抗体或单独使用不同浓度的anti-CD3抗体刺激CD4+T细胞,收取培养上清,ELISA结果显示,TRIM31缺失小鼠IL-2的分泌明显增多。qRT-PCR结果也显示TRIM31缺失后,CD4+T细胞中1l2、Ifng、Tnfa mRNA的表达水平显著增多。CD69和CD25是T细胞活化的表面标志物。我们使用同样的方法刺激T细胞,加入CD69-APC和CD25-PE荧光抗体,流式细胞术结果显示,TRIM31缺失后,CD69和CD25的表达明显增强。我们使用小鼠TRIM31（WT）及酶活性突变TRIM31（C52A,C55A）慢病毒感染TRIM31缺失的CD4+T细胞（提前活化24 h）48 h,然后继续活化处理72h,收取培养液。ELISA结果显示,回补TRIM31后,与TRIM31缺失的CD4+T细胞相比,IL-2和IFN-γ的表达明显降低,而回补TRIM31（C52A,C55A）,细胞因子的分泌无明显变化。这些结果表明TRIM31可以抑制T细胞的增殖和活化,并且依赖其泛素连接酶活性。3.TRIM31缺失促进TCR下游通路RAS-RAF-MEK-ERK的活化Anti-CD3和anti-CD28抗体可以激活T细胞表面的TCR,继而信号传导,通过多种途径活化T细胞,产生IL-2及IFN-γ等细胞因子。使用抗体处理CD4+T细胞后,Western blot结果显示,TRIM31缺失后,TCR通路上游分子ZAP70、PLCγ1磷酸化无明显变化,下游分子NF-κB、p38、JNK的磷酸化也不受影响,但是ERK的磷酸化明显增高。ERK的活化受到RAS-RAF-MEK-ERK通路调控,我们随后发现TRIM31缺失后,RAF-1的磷酸化也增强。4.TRIM31作用靶点为RAF-1根据Western blot结果,我们推测TRIM31可能作用于RAS-RAF-MEK-ERK通路来影响T细胞活化的。为了寻找靶点,我们共转染该通路各个分子,Co-IP结果表明TRIM31与RAF-1有明显的相互作用,而不与其它分子结合。在HEK293T细胞中,过表达GFP-TRIM31和Myc-RAF-1,共聚焦显微镜可以明显观察到两者之间的共定位。为了确认二者之间是否有直接结合作用,我们通过体外蛋白翻译系统翻译出RAF-1和TRIM31,Co-IP结果证实这二者是直接结合的。为了观察这两者是否在CD4+T细胞中结合,我们使用CD3和CD28抗体活化CD4+T细胞不同时间,使用anti-TRIM31做IP,Westernblot结果表明,两者之间发生诱导性结合,随着处理的时间结合逐渐增强。为了进一步探究两者之间的结合区域,我们根据结构域的分布,构建了一系列截短体。通过共转染293T细胞,免疫共沉淀结果显示,TRIM31的coiled-coil结构域与RAF-1的CR2结构域在两者的结合中起重要作用。5.TRIM31促进RAF-1的K327和K493位点K33多聚泛素化修饰5.1 TRIM31泛素化修饰RAF-1且依赖其泛素连接酶活性TRIM31是一种E3泛素连接酶,其对RAF-1是否存在修饰并且依赖其连接酶的活性需要我们进一步探究,因此我们将Myc-RAF-1、HA-Ubiquitin、Flag-TRIM31或者酶活性缺失的突变体TRIM31（C53A,C56A）共同转染入HEK293T细胞中,免疫共沉淀结果显示TRIM31确实可以泛素化修饰RAF-1,并且依赖它的酶活性。为了验证TRIM31对RAF-1修饰的特异性,我们又转染了 TCR通路上多个分子,如 CD3ζ、ZAP70、RAS、MAP2K2、MAP2K1、MAPK3、MAPK1,结果显示TRIM31对它们均无修饰。TRIM31对RAF-1同家族成员BRAF也不发挥泛素化修饰的功能。同样的,我们共转染了 RAF-1与多种TRIM分子,泛素化实验结果显示仅有TRIM26和TRIM31泛素化修饰RAF-1,且TRIM31的泛素化修饰作用较强。在生理情况下,获取刺激后的T细胞,检测RAF-1的内源泛素化,Co-IP结果显示,在受到刺激后,RAF-1会发生泛素化修饰,而TRIM31缺失后,RAF-1的泛素化明显减弱。5.2 TRIM31催化RAF-1 K33位多聚泛素化修饰由于多聚泛素链的多样化,且功能不同。为了确定TRIM31对RAF-1修饰的泛素形式,我们在HEK293T细胞中过表达多种形式的泛素链,免疫共沉淀实验发现TRIM31明显增强RAF-1 K33多聚泛素化修饰。我们又利用体外泛素修饰系统,加入体外翻译好的TRIM31和RAF-1蛋白及E1、UbcH5a、泛素分子,结果显示,在体外TRIM31能够直接催化RAF-1的K33位多聚泛素化修饰。5.3 TRIM31泛素化修饰RAF-1的K327和K493位点我们为了寻找TRIM31对RAF-1修饰的赖氨酸位点,利用HEK293T细胞,过表达Flag-TRIM31、Myc-RAF-1及HA-Ubiquitin。考马斯亮蓝染色后,进行质谱分析,结果表明RAF-1的K327和K493位点上可能存在泛素化修饰。我们为了验证这一结论,又构建了 RAF-1赖氨酸位点突变为精氨酸的单点突变和双点突变体,将它们与TRIM31和HA-Ubiquitin（K33）共转染HEK293T,免疫共沉淀结果表明TRIM31确实促进了 RAF-1的K327和K493位点的K33位多聚泛素化修饰。6.TRIM31抑制RAF-1与RAS的结合上述结果表明TRIM31可以结合并泛素化修饰RAF-1,那么被泛素化修饰的RAF-1如何影响T细胞活化还需要更进一步的探究。RAF-1活化的第一步是由RAS招募到膜上,然后才被激酶磷酸化修饰而启动活化。因此,我们获取Trim31fl/fl和Trim31fl/flCd4Cre小鼠的CD4+T细胞,经anti-CD3和anti-CD28处理后,提取蛋白,免疫共沉淀结果显示,TRIM31缺失后,RAF-1与RAS的结合明显增多。我们同样又使用共聚焦显微镜观测到了一致的现象。接着,我们利用HEK293T细胞,过表达了野生型TRIM31及TRIM31酶活性缺失突变体,实验结果显示:过表达TRIM31可以明显抑制RAF-1与RAS的结合,而酶活突变体却不发挥作用。另外,我们也过表达了 RAF-1及RAF-1的突变体（K327R,K493R）,免疫共沉淀结果显示,TRIM31能够抑制野生型RAF-1与RAS的结合,对RAF-1（K327R,K493R）与RAS的结合不起作用。7.Trim31fl/flCd4Cre小鼠在EAE模型中更易患病体外实验证明了 TRIM31可以通过泛素化RAF-1抑制CD4+T细胞增殖与活化,接下来我们通过小鼠模型检验TRIM31在体内调控CD4+T细胞活化的功能。多发性硬化症（MS）是一种CD4+T细胞诱发的自身免疫疾病,与实验性变态反应性脑脊髓炎（EAE）的发病机制及病理损伤相似。因此,我们选取6-7周Trim31fl/fl和Trim31fl/flCd4Cre雌性小鼠,皮下注射MOG35-55抗原及腹腔注射百日咳毒素,每日观察并记录炎症评分。我们发现,Trim31fl/flCd4Cre小鼠更早的出现肢体麻痹,后肢瘫痪等症状,并且比Trim31fl/fl小鼠临床评分更高。脊髓组织切片HE和LFB染色结果显示,Trim31fl/flCd4Cre小鼠中枢神经系统炎性细胞浸润更多,并且脱髓鞘更为严重。同时血清中IFN-γ的产生显著增多。大脑组织的流式细胞术结果表明,Trim31fl/flCd4Cre小鼠CNS中浸润了更多的CD4+T细胞,INF-γ+CD4+T细胞的比例和细胞数也明显的增多。尽管IL-17A+细胞在CD4+T细胞的占比没有发生变化,但浸润CNS的总体细胞数目也显著增多。使用流式细胞术检测小鼠的淋巴结及脾脏细胞,结果显示,TRIM31缺失小鼠的CD4效应T细胞明显增多,且产生更多的IFN-γ。这些结果表明,TRIM31缺失后,CD4+ T细胞更易活化,并产生大量IFN-γ,加速EAE疾病进程。8.Trim31fl/flCd4Cre小鼠有更强的抗肿瘤功能CD4+T细胞的活化在抗肿瘤中是不可或缺的,一方面可以帮助活化CD8+T细胞,使其分化为细胞毒性T细胞,杀伤肿瘤细胞;另一方面,可以分泌细胞因子IFN-y来履行抗肿瘤的职责。因此我们使用稳转荧光素酶的B16细胞构建小鼠皮下成瘤模型来探究TRIM31对CD4+T细胞活化的影响。在皮下注射B16细胞后的第7天、11天、15天、19天,使用小动物活体成像系统,观察B16黑色素瘤生物发光的情况。结果显示,Trim31fl/flCd4Cre小鼠出现瘤体较晚,且荧光素酶活性更低。ELISA检测发现血清中IFN-y明显增多。随后取小鼠淋巴结、脾脏和瘤体,研磨得到单细胞悬液,使用流式细胞术检测,结果显示,Trim31fl/flCd4Cre小鼠各个组织中CD4+T细胞IFN-γ产生明显增多。综合这两个动物模型的结果表明,TRIM31可以抑制CD4+T细胞的活化和Th1细胞的极化。一旦缺失,会导致小鼠易出现自身免疫疾病,但增强了抗肿瘤能力。四、创新性1.TRIM31在各种肿瘤发展进程及抗病毒、抗真菌免疫方面有着非常重要的作用。我们首次发现TRIM31在适应性免疫中也占有一席之地,它可以通过泛素化修饰RAF-1抑制T细胞的活化。我们的研究丰富了 TRIM31在免疫系统中的功能,拓展了 TRIM家族成员参与调控T细胞活化的研究。2.通过动物模型,我们发现TRIM31可以抑制T细胞活化和Th1的极化,完善了 T细胞活化的负调节机制。3.关于RAF-1的泛素化修饰多集中在促进其降解方面,而我们首次发现了TRIM31对RAF-1可以进行K33位非降解形式的泛素化修饰。RAF-1的K327和K493位点的泛素化修饰可以抑制RAF-1的活化。