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研究背景寨卡病毒(Zika Virus,ZIKV)属于黄病毒属正链RNA病毒家族。该病毒是一种典型的蚊媒传播的黄病毒,同时还可以通过母婴传播、性传播和血液传播。ZIKV以多聚蛋白的形式表达,包含3个结构蛋白(C、pr M/M、E)和7个非结构蛋白(NS1-5)。受ZIKV感染的成年人通常无症状,但也可引起轻度发热、头痛、关节痛、结膜炎等;孕妇感染ZIKV会导致胎儿严重的小头畸形、神经发育缺陷甚至死亡。探究ZIKV与宿主细胞之间的作用机制可以对防治寨卡病毒提供新的方向和思路。膜骨架蛋白4.1R是4.1超家族的成员之一,最初在人的成熟红细胞中被发现。蛋白4.1R能够促进血影蛋白-肌动蛋白结合,有助于细胞膜骨架在膜上的连接,并且它能够与多种跨膜蛋白相互作用,对细胞正常形态的维持、粘附、信号转导等生理功能发挥着极其重要的作用。实验室前期研究证明:蛋白4.1R通过抑制CD4+T细胞受体TCR介导的信号转导从而对CD4+T淋巴细胞活化及增殖发挥负调控作用;4.1R缺失小鼠CD4+T细胞过度活化及过度增殖,并增加IL-2和IFNγ的产生。有文献研究发现:细胞膜骨架蛋白在病毒感染和复制过程中起到关键的作用。血影蛋白(Spectrin)家族成员SPTBN1在病毒进入细胞的后续步骤起关键作用,SPTBN1能够与HIV-1 gag p55牢固结合,促进HIV-1对巨噬细胞的感染;肌动蛋白(Actin)是DENV-Ⅱ和DENV-Ⅳ感染宿主细胞所必须的膜骨架蛋白,它能够与DENV的包膜(E)蛋白相互作用,从而参与DENV进入宿主细胞。但是蛋白4.1R在病毒感染和复制过程中的作用及机制未见报道。本研究利用野生型和蛋白4.1R缺失的小鼠胚胎成纤维细胞,对蛋白4.1R是否影响DENV/ZIKV感染MEF细胞进行了研究。研究结果充分提示蛋白4.1R参与ZIKV感染宿主细胞的进入过程。蛋白4.1R可能成为一种新的治疗靶点,将有望推动ZIKV治疗的进展。研究方法1.利用PCR扩增和Western Blot技术,分别从基因水平和蛋白水平鉴定4.1R+/+MEF和4.1R-/-MEF细胞中蛋白4.1R的表达情况。2.真核表达重组质粒p EGFP-4.1R(135 k Da)、p EGFP-4.1R(80 k Da)和p CMV3-E-HA的构建。3.利用实时荧光定量PCR法检测蛋白4.1R对DENV感染的影响。4.利用DENV-ⅡLuc+复制子并通过检测荧光素酶报告基因的活性来测定蛋白4.1R对DENV复制的影响。5.利用实时荧光定量PCR和Western Blot技术,分别在RNA水平和蛋白水平上检测蛋白4.1R对ZIKV感染的影响。6.噬斑法检测ZIKV感染4.1R+/+MEF和4.1R-/-MEF细胞后子代病毒的感染力。7.流式细胞术检测4.1R+/+MEF和4.1R-/-MEF细胞表面受体AXL和Tyro3的表达。8.实时荧光定量PCR技术检测ZIKV感染4.1R+/+MEF和4.1R-/-MEF细胞后病毒的结合和进入情况。9.电镜检测ZIKV感染4.1R+/+MEF细胞和4.1R-/-MEF细胞后病毒的进入及复制情况。10.免疫共沉淀法检测蛋白4.1R与ZIKV E蛋白的相互作用。研究结果1.PCR扩增结果表明,4.1R+/+MEF细胞c DNA经扩增后得到大小约为2500bp和1700 bp两条条带,而4.1R-/-MEF细胞则没有扩增出条带;Western blot结果显示,4.1R+/+MEF细胞中表达两种4.1R蛋白亚型,大小分别为135 k Da和80k Da,而4.1R-/-MEF细胞则不表达135 k Da和80 k Da的蛋白4.1R。2.利用分子克隆技术成功构建真核表达重组质粒p EGFP-4.1R(80 k Da)、p EGFP-4.1R(135 k Da)和p CMV3-E-HA。3.利用实时荧光定量PCR法检测蛋白4.1R对DENV感染及复制的影响。结果显示,与阳性对照Vero细胞相比,4.1R+/+MEF细胞和4.1R-/-MEF细胞的病毒载量很低且具有显著性差异(P<0.01),而4.1R+/+MEF细胞和4.1R-/-MEF细胞之间的病毒载量没有显著性差异。4.将DENV-ⅡLuc+分别感染Vero、4.1R+/+MEF和4.1R-/-MEF细胞并培养48 h后,通过检测细胞中荧光素酶报告基因的活性来测定蛋白4.1R对DENV复制的影响。荧光素酶检测结果表明,与阳性对照细胞Vero相比,4.1R+/+MEF细胞和4.1R-/-MEF细胞的荧光素酶报告基因的活性水平很低并具有极其显著的差异(P<0.0001);而4.1R+/+MEF细胞和4.1R-/-MEF细胞之间的活性没有显著性差异。5.分别用实时荧光定量PCR法和Western Blot技术检测蛋白4.1R对ZIKV感染及复制的影响。结果显示,ZIKV能够感染Vero和4.1R+/+MEF细胞,但是4.1R-/-MEF细胞感染48 h后收取的上清和细胞检测到病毒RNA水平远远低于Vero和4.1R+/+MEF细胞,差异显著且具有统计学意义;用ZIKV感染48 h后,阳性对照Vero细胞和4.1R+/+MEF细胞,在53 k Da左右有条带表达,说明感染后4.1R+/+MEF细胞和Vero细胞能够表达ZIKV E蛋白;而4.1R-/-MEF细胞无条带。综上实验结果可得,蛋白4.1R的缺失能够影响ZIKV感染MEF细胞。6.噬斑法检测ZIKV感染4.1R+/+MEF和4.1R-/-MEF细胞后子代病毒的感染力。结果表明,Vero细胞和4.1R+/+MEF细胞感染后的上清,再次感染Vero后培养5 d能够出现噬斑,但4.1R-/-MEF细胞感染后的上清感染后不能出现噬斑,说明4.1R+/+MEF细胞感染后产生的子代病毒是具有感染力的,而4.1R-/-MEF细胞感染后产生的子代病毒无感染力。7.用流式细胞术检测了受体AXL和Tyro3在4.1R+/+MEF和4.1R-/-MEF细胞上的表达情况。结果显示,受体AXL和Tyro3在4.1R+/+MEF和4.1R-/-MEF细胞上均有表达。8.实时荧光定量PCR的方法检测ZIKV感染4.1R+/+MEF和4.1R-/-MEF细胞后病毒的吸附和进入。结果显示,蛋白4.1R的缺失不影响ZIKV与MEF细胞的吸附和结合,但是能够影响ZIKV进入MEF细胞。9.电镜检测ZIKV感染4.1R+/+MEF细胞和4.1R-/-MEF细胞后病毒的进入及复制。结果显示,在ZIKV感染后4 h、24 h及48 h时,阳性对照Vero和4.1R+/+MEF细胞在细胞内都能看到完整的病毒颗粒。在病毒感染4 h的时候,Vero和4.1R+/+MEF细胞内能够看到病毒颗粒,说明病毒能够进入Vero和4.1R+/+MEF细胞内。在病毒感染24 h和48 h的时候,细胞内的病毒数量增多,说明病毒能够在Vero和4.1R+/+MEF细胞中进行复制和增殖。但是在4.1R-/-MEF细胞感染ZIKV后,细胞内没有看到病毒颗粒。10.用抗4.1R的抗体把4.1R和ZIKV E蛋白共沉淀,可以看出在细胞中蛋白4.1R和ZIKV E蛋白共同免疫沉淀,以上结果说明,蛋白4.1R可能通过与ZIKV的E蛋白相互作用从而影响ZIKV进入MEF细胞。研究结论首先分别在基因水平和蛋白水平鉴定4.1R+/+MEF和4.1R-/-MEF细胞中蛋白4.1R的表达情况并成功构建了p EGFP-4.1R载体和p CMV3-E-HA载体。用3种不同的方法证明了蛋白4.1R的缺失不影响登革病毒感染MEF细胞。接下来在RNA水平和蛋白水平上证明了ZIKV能够感染4.1R+/+MEF和4.1R-/-MEF细胞,且蛋白4.1R的缺失能够影响ZIKV感染MEF细胞。对其作用机制进行初步探究发现:蛋白4.1R的缺失不影响ZIKV与MEF细胞的吸附和结合,但是影响ZIKV进入MEF细胞;蛋白4.1R可能通过与ZIKV的E蛋白相互作用从而影响ZIKV进入MEF细胞。