研究背景与意义:癌症是世界范围内最主要的公共健康问题。据新近Global cancer statistics发表的全球数据表明,癌症每年的新发病例数大约为14100000,死亡病例数为8200000。胃癌(Gastric cancer, GC)的发病率在癌症中位于第5位,而其引起的相关死亡率位于第3位。东亚地区是胃癌在世界范围内发病率最高的地区,新近数据表明我国2015年胃癌新发病例数约为68万,死亡病例数约为50万。在国内统计的所有癌症类型中,胃癌新发和死亡病例数均位于第二位。现阶段虽然临床治疗胃癌的技术手段有了不断的改进提高,如一些新的肿瘤化疗药物的应用以及肿瘤免疫疗法的实践,但世界范围内胃癌患者的5年生存率并没有显著的提高和改善。胃癌是一类异质性强的恶性肿瘤,胃癌的早期发现和诊断困难,很多胃癌患者确诊时都处于胃癌的恶性进展期,同时胃癌的发生和进程中分子病理机制复杂,至今仍然有很多不清楚的地方,这些因素均导致胃癌患者的预后不良,5年生存率较低。因此深入认识胃癌起始和进程中的分子病理机制,对于提高胃癌患者的早期发现、诊断、治疗具有重要的临床价值和意义。随着测序技术不断的进展,目前认为人类的整个基因组上有85%的区域能够被转录。然而编码蛋白的RNA转录本远小于转录的RNA数量,这表明大量的转录本不编码蛋白,这些RNA转录本被称为非编码RNA(Non-coding RNAs, ncRNAs)。由于这些ncRNAs大量存在,这就提示ncRNAs在生命活动和生物学过程中可能发挥多种不同的功能,而不是转录的噪音或者参与者。ncRNAs可以粗略分为两大类,主要的依据是基于RNA核苷酸的长度大小。一般将长度少于200个核苷酸的称为short RNAs。另一大类称为长链非编码RNAs (lncRNAs),其长度一般大于200个核苷酸。现阶段对lncRNAs的生物学特征和功能仍然知之甚少。而越来越多的研究认为,lncRNAs是转录调控的基本原件,这种观点让研究者迅速开始关注阐释lncRNAs分子机制以及其功能作用。lncRNAs按照功能特征划分了几类,这些功能特征包括发挥信号、分子诱饵、支架、增强子RNAs、短肽的作用。lncRNAs发挥分子信号传递的作用主要是对外界刺激的反应,因此它的产生和存在可以作为转录活性的指示灯。lncRNAs发挥分子诱饵的功能主要是基于其本身包含了很多结合位点,这些结合位点可以发挥诱饵的功能。lncRNAs可以隐退隔绝许多调控因子的功能,这些调控因子包括转录因子、催化蛋白、较大染色质修饰复合物的底物,还包括的重要一类就是miRNAs。发挥支架作用的lncRNAs,主要通过发挥其结构的功能作用。发挥指引功能的lncRNAs主要是直接与RNP复合体结合,从而指引RNP复合体作用特定的靶基因。现研究表明,一些lncRNAs与机体正常发育和人类疾病有功能性的关联。lncRNAs参与了多种生物进程,其中包括胚胎干细胞、辅助性T细胞的分化、自噬、心肌梗塞、细胞衰老、癌细胞的凋亡及转移、化疗药物的抵抗。而在癌症领域,已经发现lncRNAs在多种癌症中转录表达失调,并与癌症的复发和不良预后相关,这些癌症包括神经胶质瘤、乳腺癌、结直肠癌、肝癌和白血病等。通常lncRNAs表达失调将会影响细胞的生物学功能,其中包括细胞的增殖,对凋亡的抵抗,介导血管的生成,以及促进转移,逃避肿瘤抑制子的作用。这些lncRNAs主要通过沉默抑癌基因,激活原癌基因的表达而参与肿瘤的发生和转移,而其沉默抑癌基因和激活原癌基因的具体机制包括表观遗传修饰、可变剪切、RNA衰减以及翻译后修饰调控。因此,lncRNAs发挥原癌基因或肿瘤抑制子的功能而参与了肿瘤的发生,其具体发挥抑癌或原癌的功能主要依赖于肿瘤的类型以及微环境。截至目前,几种lncRNAs在胃癌中的功能特征已经被较好的阐释,特别是HOTAIR, ANRIL, H19, GAPLINC,PVT1 和 LINC00152。HOTAIR 与胃癌淋巴结转移和TNM分期相关,siRNA敲低HOTAIR表达,显著抑制胃癌细胞的侵袭。H19在胃癌细胞系和胃癌组织中表达上调,并与胃癌淋巴结转移和TNM分期相关,过表达H19通过主动结合ISM1而促进了胃癌细胞的增殖和侵袭。GAPLINC在胃癌组织中高表达并且作为miR-211-3P的分子诱饵调控CD44的表达而促进胃癌细胞的增殖和迁移。LNC00152表达与多种临床病理特征相关,干扰LINC00152的表达能够有效抑制胃癌细胞的增殖和克隆形成,以及在G1期促进细胞周期的阻滞,引发细胞的后期凋亡,减少EMT以及抑制细胞的迁移和侵袭。现假定仍然有大量的lncRNAs在胃癌中的表达失调,特别是胃癌特异性的lncRNAs。而研究这些lncRNAs能否作为胃癌诊断标志物,如何参与胃癌的起始和进程,以及如何调控胃上皮细胞的增殖、侵袭和转移,这对理解胃癌的起始与进程具有重要的临床意义,也为胃癌的诊断与治疗提供新的理论依据。研究方法:第一部分:长链非编码RNAAFAP1-AS1在胃癌中的表达及临床意义1.高通量lncRNAs转录组芯片测定5例胃癌患者癌组织和癌旁组织的lncRNAs转录表达谱。通过配对T检验筛选癌组织和癌旁组织差异转录的lncRNAs,以P值小于0.05为差异筛选标准。2.实时荧光定量PCR ( qRT-PCR )检测临床样本库中80例胃癌组织和癌旁组织AFAP1-AS1相对定量表达水平,配对T检验比较分析AFAP1-AS1在癌组织与癌旁组织的差异表达。3.结合胃癌患者的临床病理资料,分析AFAP1-AS1的表达与胃癌患者临床病理特征(分期分级、病理组织类型)以及预后(生存率)的相关性。4.受试者工作特征曲线(ROC)分析80例胃癌患者癌组织和癌旁组织AFAP1-AS1的相对表达水平,评价AFAP1-AS1作为胃癌诊断标志物的敏感性和特异性。第二部分:长链非编码RNA AFAP1-AS1促进胃癌增殖、侵袭和转移的分子作用机制5. qRT-PCR 检测胃癌细胞 SGC-7901 和 MKN-45 在转染 LV-AFAP1-AS1-shRNA后AFAP1-AS1的表达水平,分析干扰后表达差异。6.为评价AFAP1-AS1对胃癌细胞增殖能力的影响,在胃癌细胞中转染LV-AFAP1-AS1-shRNA和LV-shRNA-NC。采用CCK-8实验评价两组胃癌细胞增殖能力的差异。7.为评价AFAP1-AS1对胃癌细胞侵袭转移表型的影响,在胃癌细胞中转染LV-AFAP1 -AS1-shRNA和LV-shRNA-NC。采用Transwell侵袭、转移实验评价两组胃癌细胞侵袭转移能力的差异。8.为证实AFAP1-AS1与miR-200a结合,采用生物信息学软件Targetscan预测AFAP1-AS1潜在结合的miRNAs和双荧光素酶报告基因实验鉴定AFAP1-AS1是否与miR-200a 结合。9.为评价AFAP1 -AS 1对表皮间质转移(EMT )关键蛋白ZEB1和ZEB2的影响,在胃癌 SGC-7901 和 MKN-45 细胞中转染 LV-AFAP1-AS1-shRNA 和 LV-shRNA-NC。采用qRT-PCR和western blot检测两组细胞ZEB 1和ZEB2的表达。10.为评价AFAP1-AS1对表皮间质转移(EMT)标志物E-cadherin,N-cadherin和 Vimentin 的影响,在胃癌细胞 SGC-7901 和 MKN-45 中转染 LV-AFAP1-AS1-shRNA和 LV-shRNA-NC。采用 qRT-PCR 和 western blot 检测两组细胞 E-cadherin, N-cadherin和Vimentin的表达。11.qRT-PCR检测胃癌患者癌组织中ZEB1的表达水平,Pearson相关性分析胃癌组织中AFAP1-AS1与ZEB1表达的相关性。研究结果:第一部分:长链非编码RNAAFAP1-AS1在胃癌中的表达及临床意义1. lncRNAs转录组芯片筛选差异表达lncRNAs共计有416条(P<0.05 )。其中与癌旁组织相比较,癌组织中显著表达上调的lncRNAs共计282条(P<0.05),癌组织中显著表达下调的lncRNAs共计134条(P<0.05 )。2. qRT-PCR检测发现AFAP1-AS1在胃癌组织相比较于癌旁组织,其表达上调,差异具有统计学意义(P<0.05)。3. TNM Ⅲ/Ⅳ(39例)患者癌组织中的AFAP1-AS1定量表达水平高于TNM Ⅰ /Ⅱ(41例)患者癌组织中的定量表达水平,差异具有统计学意义(P<0.05)。高表达AFAP1-AS1组患者的生存率显著低于AFAP1-AS1低表达组患者生存率,差异具有统计学意义(P<0.001)。4. ROC曲线评价AFAP1-AS1作为诊断标志物的AUC为0.8802,灵敏度为81.25%,特异度为 87.69%。第二部分:长链非编码RNAAFAP1-AS1促进胃癌增殖、侵袭和转移的分子作用机制5.在SGC-7901和MKN-45细胞中,与转染LV-shRNA-NC对照组相比,转染LV-AFAP1-AS1-shRNA1 组和 LV-AFAP1-AS1-shRNA2 组中 AFAP1-AS1 的定量表达水平下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。6.在SGC-7901和MKN-45细胞中,与转染LV-shRNA-NC对照组相比,转染LV-AFAP1-AS1-shRNA1 组和 LV-AFAP1-AS1-shRNA2 组在转染后 1day,2days, 3days,4days的吸光度OD450平均值降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。7.在SGC-7901细胞中,与转染LV-shRNA-NC对照组相比,转染LV-AFAP1-AS1-shRNA1组在转染后的胃癌细胞Transwell侵袭、转移穿膜细胞数量减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。8.共转染miR-200a和pmirGLO-AFAP1-AS1组的相对荧光素酶活性值低于共转染miR-NC和pmirGLO-AFAP1-AS1组的相对荧光素酶活性值,差异有统计学意义(P<0.05) 。9.在 SGC-7901 和 MKN-45 细胞中,转染 LV-AFAP1-AS1-shRNA 组与转染LV-shRNA-NC对照组相比,ZEB1和ZEB2的相对定量mRNA表达水平和蛋白表达水平均下降,差异有统计学意义(P<0.05)。10.在 SGC-7901 和 MKN-45 细胞中,转染 LV-AFAP1-AS1-shRNA 组与LV-shRNA-NC组相比,E-cadherin的相对定量mRNA表达水平和蛋白表达升高,N-cadherin和Vimentin的相对定量mRNA表达水平和蛋白表达均下降,差异有统计学意义(P<0.05)。11. 80例胃癌组织中AFAP1-AS1相对定量的表达与ZEB1的相对定量表达水平呈正相关,其中相关系数r=0.6624, R2值为0.4388 (P<0.05)。研究结论:第一部分:长链非编码RNAAFAP1-AS1在胃癌中的表达及临床意义lncRNA转录组芯片筛选了胃癌相关lncRNAs, AFAP1-AS1在胃癌组织和胃癌细胞系中显著高表达。AFAP1-AS1的表达与胃癌的临床病理特征、TNM分期和不良生存率相关。受试者工作特征曲线(ROC)分析AFAP1-AS1作为胃癌潜在的诊断标志物敏感性和特异性良好。第二部分:长链非编码RNA AFAP1-AS1促进胃癌增殖、侵袭和转移的分子作用机制干扰AFAP1-AS1的表达抑制了胃癌细胞的增殖、侵袭和转移能力。干扰AFAP1-AS1抑制了胃癌细胞中EMT通路关键蛋白ZEB1和ZEB2的表达。生物信息学软件预测和双荧光素酶报告基因实验证实AFAP1-AS1能够与肿瘤抑制子miR-200a结合。AFAP1-AS1可能通过发挥分子海绵的吸附功能,结合miR-200a,从而抑制了miR-200a对EMT通路关键蛋白ZEB1的调控,进而促进了 ZEB1和ZEB2表达,参与了胃癌增殖、侵袭和转移等过程。该研究首次阐释AFAP1-AS1-miR-200a-ZEB1/ZEB2轴在调控胃癌细胞增殖、侵袭和转移方面的作用,为胃癌的诊断和治疗提供了新的靶点和理论依据。