1虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ的生物素标记与受体分析虎纹捕鸟蜘蛛[Selenocosmia(=ornithoctonus)huwena]是分布在我国西南部山区的一个蜘蛛新种。它的粗毒中含有多种活性成分,其中研究得比较深入的多为多肽神经毒素。虎纹捕鸟蜘蛛毒素-Ⅰ(Huwentoxin-Ⅰ,HWTX-Ⅰ)是虎纹捕鸟蛛粗毒中含量最高的一种多肽类神经毒素。它由33个氨基酸残基组成,其中的6个Cys形成3对二硫键,能可逆性阻断小鼠膈神经膈肌接头的传递,作用位点在突触前膜。膜片钳分析提示它是一种N型钙离子通道阻断剂。为了对HWTX-Ⅰ在细胞质膜上的受体蛋白进行分离纯化和鉴定,获得关于HWTX-Ⅰ作用机理的更直接的证据,本研究首先优化了HWTX-Ⅰ生物素标记的实验条件,分析了生物素标记对HWTX-Ⅰ活性的影响,然后利用基于生物素-亲和素系统的亲和纯化和蛋白质组学分析技术,对HWTX-Ⅰ在大鼠膈神经-膈肌突触细胞质膜上的受体蛋白进行了分离纯化与鉴定。标记实验结果表明当生物素标记试剂与HWTX-Ⅰ的摩尔比为2:1时,大部分HWTX-Ⅰ分子只被标记上一个生物素分子,标记率达42%。质谱分析和电生理实验表明该生物素基团标记在HWTX-Ⅰ的Lys13上,标记后不影响HWTX-Ⅰ的生理活性。亲和纯化出来的受体蛋白组分经SDS-PAGE分离、胰蛋白酶酶解和质谱鉴定,我们鉴定到了几种HWTX-Ⅰ的可能受体。2过甲酸氧化辅助酶切法在质膜蛋白质组学中的应用质膜蛋白在许多生物学过程中起重要作用,是许多药物的作用靶标。细胞质膜蛋白质组研究正成为蛋白质组学的研究热点。然而由于整合膜蛋白低丰度和疏水的性质,使得其很难被分析和鉴定。在蛋白质组学分析过程中,疏水性肽段和跨膜肽段常常很难被鉴定到,这样就降低了蛋白总的覆盖率和蛋白被鉴定的可靠性。本研究报道了一种膜上酶解新策略,用于膜蛋白质的鉴定。该策略的特点是引入了过甲酸氧化处理(PAOT)。由于过甲酸试剂能将半胱氨酸残基和甲硫氨酸残基分别氧化为半胱磺酸和甲硫氨酸砜,这使得蛋白的疏水性大大降低,增加了疏水性肽段的酶切和检测效率,这非常有利于分析鉴定疏水性强的蛋白。以人类CNE1细胞系为材料,我们比较了PAOT辅助酶解与另外二种常用的酶解方法:胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶酶解和甲醇酶解。结果表明,甲醇酶解法鉴定到72个整合膜蛋白,其中平均疏水值大于0的蛋白数为31;胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶酶解法共鉴定到59个整合膜蛋白,其中平均疏水值大于0的蛋白数为40个;PAOT法共鉴定到101个整合膜蛋白,其中平均疏水值大于0的蛋白数为67个。因此,比起其它两种传统的方法,过甲酸氧化辅助酶解方法能鉴定到更多的高疏水性多跨膜区蛋白质,更适合膜蛋白质组分析。