结核病被列为全因死亡的第10大原因,并且是单一病原体致死率最高的感染性疾病。WHO“终结结核战略”的目标为:在2015年至2035年期间将结核相关死亡人数减少95%,并将结核病发病率降低90%。据2020年《全球结核病报告》,2019年全球新增结核病病例约1000万,结核病相关死亡病例约140万,目前全球约有17亿人为结核潜伏感染（Latent Tuberculosis Infection,LTBI）。因此,预防并阻止LTBI感染向活动性结核病（Active Tuberculosis,ATB）进展是我们实现“终结结核战略”目标的关键。研究表明,Th17在抗结核感染中发挥保护作用,并可能有助于维持潜伏感染状态。如:Th17能促进三级淋巴结构（Tertiary Lymphoid Structures,TLS）的形成而增强抗原提呈细胞（Antigen-presenting Cells,APC）与淋巴细胞的接触、增强Th1型免疫反应;Th17还可诱导基质细胞表达趋化因子进而招募多形核粒细胞（Polymorphonuclear,PMN）至结核感染部位。研究发现,肠道微生物群与抗结核感染免疫相关。如:ATB患者肠道中普雷沃菌属（Prevotella）比例较健康对照显著降低,且ATB患者外周血CD4+T细胞数量与肠道普雷沃菌属相对丰度呈正相关,说明肠道普雷沃菌属可能有助于宿主免疫系统抵抗结核感染。有意思的是,有体外研究证实普雷沃菌能够诱导Th17分化,如将产黑普雷沃菌作用于分离自淋巴结的T细胞,可使Th17显著增多,IL-17A表达水平显著提高。基于此,我们推测:肠道普雷沃菌可能通过诱导肠道Th17分化而调节肠道和肺部粘膜免疫,发挥抗结核感染的保护作用。本研究利用小鼠感染模型,主要进行以下研究:（1）探讨肠道普雷沃菌与结核感染状态的关系;（2）验证肠道普雷沃菌诱导小鼠结肠Th17细胞分化并探索相关机制;（3）明确IL-17A的抗结核感染保护作用;（4）验证肠道普雷沃菌及其调控的Th17免疫在分枝杆菌感染中的保护作用。第一部分肠道普雷沃菌与结核分枝杆菌潜伏感染相关目的:探讨结核感染不同病理生理阶段的肠道菌群特征,寻找与结核潜伏感染相关的肠道细菌。方法:使用16S r DNA测序的方法检测19名活动性肺结核病（Active Tuberculosis,ATB）患者、21名结核潜伏感染者（Latent Tuberculosis Infection,LTBI）和20例健康对照（Healthy Control,HC）的肠道微生物群的构成;使用Spearman相关分析检验特异性富集的肠道细菌相对丰度与干扰素释放实验（Interferon Gamma Release Assay,IGRA）中干扰素γ（Interferon-Gamma,IFN-γ）释放量之间的相关性。结果:在群落多样性方面,LTBI和ATB组的肠道微生物多样性显著低于HC组;在物种构成方面,与HC组相比,结核分枝杆菌感染者（LTBI组和ATB组）梭菌纲相对丰度显著下降,与HC组和ATB组相比,LTBI组普雷沃菌属（Prevotella）相对丰度显著升高;三组的特异性富集物种分别是:（1）肠杆菌科（Enterobacteriaceae）、肠杆菌目（Enterobacteriales）、γ变形菌纲（Gammaproteobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）和Erysipelatoclostridium特异性富集于ATB组;（2）普雷沃菌属（Prevotella）和罗氏菌属（Roseburia）特异性富集于LTBI组;（3）梭菌纲（Clostridia）、梭菌目（Clostridiales）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）、疣微菌科（Ruminococcaceae）、粪杆菌属（Faecalibacterium）、Agathobacter属、Subdoligranulum属、瘤胃球菌属（Ruminococcus）和Fusicatenibacter属特异性富集于HC组;普雷沃菌属（LTBI组特异性富集物种）的相对丰度与结核菌抗原诱导的外周全血IFN-γ释放量呈正相关,而梭菌纲、梭菌目、Agathobacter属和Subdoligranulum属（HC组特异性富集物种）的相对丰度与结核菌抗原诱导的外周全血IFN-γ释放量呈负相关。结论:结核分枝杆菌感染后肠道微生物多样性显著下降且物种构成显著改变,普雷沃菌属是LTBI的特异性富集物种且与抗结核免疫相关。第二部分肠道普雷沃菌诱导小鼠结肠Th17细胞分化目的:利用体内研究探讨肠道普雷沃菌能否诱导小鼠肠道Th17细胞分化,并进一步研究作用机制。方法:给予C57BL/6小鼠广谱抗生素（包括氨苄西林1g/L、硫酸新霉素1g/L、盐酸万古霉素0.5g/L、甲硝唑1g/L）饮水处理4周以清除小鼠肠道细菌,再灌胃普雷沃菌4周,以粪便16S r DNA测序验证普雷沃菌在小鼠肠道的定植情况;对小鼠结肠组织切片行免疫荧光染色,对IL-17A+T细胞进行定位、定量分析;利用流式细胞术检测小鼠肠系膜淋巴结中Th17细胞的比例;检测血清中IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-17A、IL-10、IL-4、IFN-γ和IL-2的浓度,评估普雷沃菌肠道定植后对炎症相关细胞因子的影响;通过体外实验将普雷沃菌及其他对照细菌灭活培养物与骨髓来源的树突状细胞（Bone Marrow-derived Dendritic Cells,BMDC）共孵育再检测细胞培养液中相关细胞因子变化情况,评估普雷沃菌能否诱导DC产生Th17分化相关细胞因子;分别使用Toll样受体2（Toll-like Receptor,TLR2）和TLR4抑制剂与普雷沃菌灭活菌体及BMDC细胞共孵育,再检测培养上清中IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-12p70,验证普雷沃菌诱导Th17分化的过程主要由哪种TLR介导。结果:广谱抗生素处理4周后成功清除了小鼠肠道菌群,继而经普雷沃菌灌胃4周后确认其成功定植于小鼠肠道内,并诱导了小鼠肠系膜淋巴结中Th17细胞的增加及结肠组织中IL-17A+T细胞数目的增加;同时,普雷沃菌定植肠道后,小鼠血清中细胞因子IL-17A与IL-6水平显著升高;体外实验中,受普雷沃菌刺激后BMDC产生能够诱导Th17分化的细胞因子（IL-6和IL-1β）,且TLR2阻断剂可显著抑制这一过程。结论:肠道普雷沃菌可诱导结肠Th17细胞分化,BMDC产生的Th17细胞分化相关细胞因子主要由TLR2介导。第三部分IL-17A在抗结核感染中的保护作用目的:探讨IL-17A在M.tb感染中的作用。方法:将15只Il-17a-/-C57BL/6雌鼠随机分为3组（KO,KO+MTB和VKO+MTB）,每组5只,另将10只野生C57BL/6雌鼠随机分为2组（WT,WT+MTB）,每组5只。KO,KO+MTB,WT和WT+MTB四组小鼠每2周皮下接种PBS,共3次;VKO+MTB组小鼠每2周皮下接种BCG 10~5cfu,共3次;然后使WT+MTB、KO+MTB与VKO+MTB组小鼠吸入感染H37Rv 10~4 cfu/只,WT组与KO组吸入PBS作对照。4周后处死全部小鼠,分别进行器官（肺、脾）荷菌量分析、肺组织HE染色病理损伤程度评估以及小鼠血清多细胞因子浓度检测。结果:与WT组相比,WT+MTB小鼠血清IL-17A水平升高（P=0.04）;与WT+MTB组相比,KO+MTB小鼠肺部荷菌量显著增加（P=0.0437）、肺部病理损伤程度更重,且血清IFN-γ水平显著下降（P=0.04）,而IL-1β和IL-4水平显著上升（P=0.004和P=0.002）;与KO+MTB组相比,VKO+MTB小鼠肺部荷菌量显著下降（P=0.0437）、肺部病理损伤程度减轻,且血清IL-1β和IL-4水平显著下降（P=0.004和P=0.001）。结论:IL-17A在小鼠抗结核感染中发挥保护作用。第四部分肠道普雷沃菌及其诱导的Th17在分枝杆菌感染中的保护作用目的:探讨肠道普雷沃菌及其诱导的Th17在小鼠结核感染免疫中有无保护作用。方法:取4-6周龄雌性C57BL/6小鼠,每组5只,共分为3组:（1）经灌胃定植人型普雷沃菌（P.copri）后,滴鼻感染BCG菌10~6 cfu/只,即PCOP+BCG组;（2）空白培养基（Blank Medium,BM）灌胃后,滴鼻感染BCG菌10~6 cfu/只,即BM+BCG组;（3）无灌胃,PBS滴鼻作对照,即BLANK组;4周后处死小鼠进行脏器（肺和肝）荷菌量分析、肺组织HE染色病理学评价、血浆细胞因子水平（IL-17A、IFN-γ和IL-6）检测,同时用流式细胞术分别分析脾和外周血中免疫细胞Th17、Treg和Th1占CD4+T细胞的比例。结果:与BM+BCG组相比,PCOP+BCG组小鼠肺部BCG荷菌量显著降低（P=0.0059）、肺部病理损伤显著减轻;与BM+BCG组及BLANK组相比,PCOP+BCG组小鼠结肠及肺组织IL-17A分布明显增加;与BLANK组相比,PCOP+BCG小鼠血清IL-17A水平显著升高（P=0.0275）;与BM+BCG组相比,PCOP+BCG组小鼠脾Th1（P=0.0325）、Th17（P=0.0079）及外周血Th1（P=0.0304）细胞比例显著增加;BLANK组无TLS结构,PCOP+BCG组小鼠TLS结构完善,而BM+BCG组小鼠TLS结构不够成熟。结论:肠道普雷沃菌调控的Th17细胞介导的免疫反应有抗分枝杆菌感染的免疫保护作用。通过以上研究,我们得出如下结论:肠道普雷沃菌与结核分枝杆菌潜伏感染相关,肠道普雷沃菌可通过DC细胞表面TLR2信号通路诱导小鼠结肠Th17细胞分化,结核分枝杆菌感染时Th17的效应细胞因子IL-17A具有降低肺部荷菌量和缓解肺部病理损伤的作用;因此,在通过灌胃而给肠道定植普雷沃菌的小鼠经呼吸道感染BCG后,普雷沃菌对分枝杆菌感染具有降低肺部荷菌量和减轻肺部病理损伤的作用,这一作用可能藉肠道普雷沃菌诱导的Th17细胞经“肠-肺”轴转位至肺部分枝杆菌感染部位而实现。我们的实验证实了肠道普雷沃菌调控的Th17在结核感染免疫中的保护作用,为阐明特定肠道细菌调节结核感染免疫的机制奠定了基础。