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目的:1.建立重组酶聚合酶扩增技术（Recombinase Polymerase Amplification RPA）15ul反应体系（本文中简称RPA-15ul反应体系）快速检测鲍曼不动杆菌的实时荧光检测方法,并同时进一步检测临床分离株,以评估该方法的临床实用性。2.选择鲍曼不动杆菌耐碳青霉烯类耐药基因中检出率最高的blaOXA-23基因作为检测目的基因,建立实时荧光重组酶聚合酶扩增技术15ul反应体系快速检测耐药基因的方法,以期检测细菌的同时完成耐药基因的测定,指导临床快速选择敏感抗生素。方法:1.分别根据鲍曼不动杆菌的鉴定基因blaOXA-51与16s-23s rRNA ITS基因的特异保守序列按照TwsitDX Inc公司提供的RPA引物与探针的设计原则设计一系列引物与探针,通过引物筛选,各选择一套最优的引物与探针分别进行特异性与灵敏性评价。以铜绿假单胞菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌四种非鲍曼不动杆菌作为阴性对照菌,采用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction PCR）、实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR qPCR）和RPA-15ul反应体系作为核酸扩增技术,分别验证两种鉴定基因引物与探针的特异性;对菌液进行梯度稀释后提取模板,采用上述三种扩增技术分别验证两种鉴定基因的灵敏性,并比较三种方法灵敏性的差异以及两种鉴定基因灵敏性的不同;同时进一步采用PCR及RPA-15ul反应体系分别扩增两种鉴定基因检测30株鲍曼不动杆菌临床分离株,以验证RPA-15ul反应体系的实际应用性。2.以30株鲍曼不动杆菌临床分离株为研究对象,采用K-B纸片琼脂扩散法（Kirby-Bauer法）检测30株临床分离株对19种抗生素的敏感情况;根据TwsitDX Inc公司提供的RPA引物与探针的设计原则设计鲍曼不动杆菌碳青霉烯类耐药基因blaOXA-23基因的引物与探针,通过PCR和RPA-15ul反应体系扩增30株鲍曼不动杆菌临床分离株的目标DNA,评估两种检测方法的检出率,并结合药物敏感实验,分析鲍曼不动杆菌耐碳青霉烯类抗生素与耐药基因bla OXA-23基因之间的联系,同时评价RPA-15ul反应体系检测耐药基因的可行性。结果:1.本研究中RPA-15ul反应体系检测鲍曼不动杆菌的鉴定基因blaOXA-51基因与16s-23s rRNA ITS基因的灵敏性相当均为2.86CFU/ml,与PCR、qPCR灵敏性一致;三种检测方法中,两种鉴定基因的特异性均为100%。RPA-15ul反应体系分别扩增两种鉴定基因检测30株临床分离株,检出率均为100%,与PCR结果完全相符。2.K-B纸片琼脂扩散法检测30株鲍曼不动杆菌临床分离株的药物敏感实验结果如下:8/30（26.7%）株对米诺环素耐药,10/30（33.3%）株表现为中介,12/30（40.0%）株表现为敏感;17/30（56.7%）株对头孢哌酮/舒巴坦耐药,8/30（26.7%）株表现为中介,5/30（16.6%）株表现为敏感;27/30（97.0%）株对阿米卡星、美洛培南、亚胺培南耐药,3/30（10.0%）株表现为敏感;28/30（93.3%）株对萘替卡星、庆大霉素、头孢他啶、妥布霉素耐药,仅2/30（6.7%）株表现为敏感;29/30（96.7%）株对氨苄西林/舒巴坦、环丙沙星、四环素、头孢吡肟、头孢噻肟、左氧氟沙星、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦耐药,仅1/30（3.3%）株表现为敏感;30/30（100%）株对复方新诺明耐药;30/30（100.0%）株临床分离株均表现为对多黏菌素B敏感。RPA-15ul反应体系扩增鲍曼不动杆菌耐碳青霉烯类耐药基因blaOXA-23基因,显示27/30（90%）株出现扩增信号,仅3/30（10%）株为阴性,与药物敏感实验结果对比发现未出现扩增的3株临床分离株均对美洛培南、亚胺培南敏感,即27株耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌（Carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii CRAB）中blaOXA-23耐药基因的检出率为100%,而3株碳青霉烯类敏感鲍曼不动杆菌（Carbapenem-sensitive Acinetobacter baumannii CSAB）均未检出blaOXA-23耐药基因;RPA-15ul反应体系的结果与PCR扩增结果完全相符。结论:1.本研究建立实时荧光重组酶聚合酶扩增技术15ul反应体系快速检测鲍曼不动杆菌的方法,两种鉴定基因blaOXA-51与16s-23s rRNA ITS基因均表现为灵敏性高,特异性高,检测快速,临床实用性强;RPA-15ul反应体系较标准50ul反应体系更为价廉,非常适合现场检测及偏远地区的推广。2.建立实时荧光重组酶聚合酶扩增技术15ul反应体系快速检测碳青霉烯类耐药基因blaOXA-23基因,实现50min内完成细菌与耐药基因的快速检测;发现碳青霉烯类耐药基因blaOXA-23基因的检出情况与鲍曼不动杆菌耐碳青霉烯类抗生素的耐药性一致。本研究实现鲍曼不动杆菌及耐碳青霉烯类耐药基因blaOXA-23基因的快速检测,有助于临床快速选择敏感抗生素,对减缓鲍曼不动杆菌耐药菌株的产生具有非常重要的意义。