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[摘要]目的:通过对TGF-β3促进软骨分化的基础和应用的研究,探究将TGF-β3应用于临床的软骨修复的可能性,力图寻找生物细胞因子用于临床治疗软骨损伤成熟的方案。方法:首先,从原代培养骨髓细胞形成的单克隆中,应用显微操作技术挑取单克隆来源的MSCs,然后在有饲养层细胞(feeder cells FCs)的条件下,进行大量扩增,在传代至P20(Passage 20)时进行细胞表面标志(STRO-1、CD34、CD45、OCT-4、CD105、Nestin)的流式鉴定,并进行这种单克隆来源的MSCs向骨、软骨、肌腱和神经样细胞分化的实验。其次,在TGF-β3促进MSCs向软骨分化的不同时间点,通过Western Blot检测Erk1/2(extracellular signal-regulated kinase-1/2 Erk1/2)磷酸化的表达,然后再用Erk1/2磷酸化抑制剂U206处理诱导分化过程中的MSCs,RealTime-PCR检测软骨分化基因(Sry-trype HMG box protein 9)Sox9、胶原Ⅱ(collagen COLⅡ)和Aggrecan(Agc)的表达的变化;之后构建Smad4在磷酸化位点Thr277突变的表达载体,转染MSCs后在分化过程中检测上述基因表达的变化。再次,从大鼠的胚胎(胚芽)中提取TGF-β3基因全长,克隆到真核表达载体pIRES2–EGFP中,构建出表达载体pIRES2–EGFP-TGF-β3,转染骨髓基质干细胞(marrow stem cell MSCs),观察转染后MSCs向软骨细胞分化的效应。在体内实验中,将转染后的MSCs接种于载体脱钙骨基质(Decalcified bone matrix DBM)后移植于软骨缺损的动物模型中,观察转染后MSCs体内修复软骨的能力。接着,应用基因工程的方法改进自然TGF-β3蛋白,构建工程化TGF-β3的表达载体pIRES-EGFP -LAP -MMP-mTGF-β3,将基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase MMP)酶切位点分别插入到前体相关蛋白(Latent Associated Protein LAP)和成熟TGF-β3(mature TGF-β3 mTGF-β3)之间,并分别转染MSCs和软骨前体细胞(Chondrogenic progenitor Cells CPCs),检测上述转染后的两种细胞球团培养( pellet culture)过程中在有MMP酶和无MMP酶的条件下COLⅡ, Agc和基质金属蛋白酶组织抑制因子(Tissue inhibitor of metalloproteinase TIMP)的表达和软骨基质中蛋白聚糖Proteoglycan的积累。最后,人工合成GADD45-β的反义核苷酸,在TGF-β3促进MSCs向软骨细胞分化的后期进行干预,并检测GADD45-β的反义核苷酸干预后对软骨终末分化因子基质金属蛋白酶13(MMP-13)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor VEGF)和胶原Х(collagenХCOLХ)表达的影响,以及对软骨基质中proteoglycan积累的影响。结果:我们成功获得了由一个单克隆MSCs扩增出来的大量单克隆来源的MSCs,而且这种单克隆来源的MSCs能被成功的诱导向骨、软骨、肌腱和神经样细胞分化。Western blot检测结果显示Erk1/2的磷酸化在TGF-β3诱导MSCs向软骨分化的过程中随着时间增加而增加,同时Erk1/2磷酸化特异性的阻滞剂U206能够成功减弱TGF-β3诱导的软骨分化和软骨基质的合成;而Erk1/2磷酸化底物Smad4在Thr277上的突变亦能减弱TGF-β3诱导的软骨分化,效果与U206类似。接着,我们成功构建了真核表达载体pIRES2–EGFP-TGF-β3并在MSCs中获得了成功和高效的表达,在接下来的细胞球团培养(pellet culture)中,转染后的MSCs成功和高效被诱导向软骨细胞分化。在体内实验中,转染了pIRES2–EGFP-TGF-β3的MSCs以DBM为载体成功修复了动物模型中的大面积软骨缺损。接下来,我们还成功构建了工程化TGF-β3的真核表达载体pIRES-EGFP-LAP-MMP-mTGF-β3,并在MSCs和CPCs中成功获得了表达,而且转染后的MSCs和CPCs只在有MMP酶的条件下能被特异性的促进向软骨细胞分化。最后,GADD45-β反义寡核苷酸对GADD45-β表达的封闭能够成功阻滞TGF-β3诱导MSCs向软骨分化后期软骨细胞的终末分化,并维持和增加软骨基质的积累。结论:单克隆来源的MSCs能被成功的诱导向中胚层和外胚层的组织细胞分化,这直接证明了MSCs的“横向分化能力”,也获得了大量的可供利用的均质MSCs;Smad4基因在Thr277上的磷酸化是TGF-β3诱导软骨分化中Erk1/2信号途径促进软骨分化的关键;TGF-β3转染MSCs后能成功的应用于大面积软骨缺损的修复;经过基因工程改造后的工程化的TGF-β3蛋白则更能特异性修复受损的软骨;而GADD45-β是TGF-β3诱导软骨分化后软骨肥大和终末分化的关键因子,其反义寡核苷酸能有效阻止软骨的终末分化。