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目的与意义:观察组织激肽释放酶1(Kallikrein,KLK1)诱导大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)移植联合黄芪注射液对心肌梗死大鼠心肌超微结构、钾离子通道蛋白和组织激肽型受体B2的影响。方法:从SPF级Wistar雄性大鼠180±20 g中随机抽取20只,随机分为正常组和假手术组(每组各10只)。采用冠状动脉结扎法建立心梗模型,将造模成功的70只大鼠用随机数字表法,随机分为:模型组、BMSCs组、阴性对照组、BMSCs+5-AZA组(阳性对照组)、BMSCs+KLK1组、BMSCs+黄芪组、BMSCs+KLK1+黄芪组,共7组,每组10只。细胞移植为将大鼠BMSCs分别加入KLK1腺病毒或5-氮杂胞苷(5-azaCytidine,5-AZA)诱导液,造模成功后14 d,在梗死心肌周围选择4个点,注射各组细胞。黄芪注射液(剂量为0.66 mL/0.2 kg·d)行腹腔注射,于细胞移植后第3 d进行,1次/日,连续7 d。BMSCs组、BMSCs+5-AZA组、BMSCs+KLK1组,术后3 d,行腹腔注射等黄芪注射液体积的生理盐水。阴性对照组,造模后第14 d,二次开胸,在梗死区仅注射细胞培养液。各组干预4 w后取材,采用电子显微镜观察心脏病理切片超微结构;采用RTPCR法检测心脏组织KLK1、激肽型B2型受体m RNA表达情况;Western Blotting技术检测心脏组织KLK1、缓释肽B2型受体、钾离子通道Kv1.2和Kv 1.5蛋白的表达水平。结果:1.电镜结果:正常组、假手术组:心肌肌原纤维排列整齐、连续,A带、I带、H带、Z线、M线清晰可见,闰盘呈阶梯状,肌原纤维之间排列着许多线粒体。模型组、阴性对照组:梗死的心肌肌原节缩短,I带消失,A带肌丝不整齐,H带、M线消失,线粒体肿胀。BMSCs移植组、BMSCs+黄芪组:病理性改变较轻,并可见幼稚的细胞,胞核大,染色质颗粒细而均匀,以常染色质为主,核周有线粒体、核糖体,可见由肌微丝刚形成的小肌原节和发育程度不同的肌原纤维,考虑为移植的B MSCs细胞分化而来,周围有较多的毛细血管,部分可见与周围正常心肌形成缝隙连接。BMSCs+KLK1组:在电镜观察中还发现有外来细胞与心肌细胞形成紧密的缝隙连接,类似闰盘结构。而在心肌中,一般只有心肌细胞之间能够形成紧密的缝隙连接。BMSCs+5-AZA组:有的外来细胞形态介于成纤维细胞与心肌细胞,内也有肌丝样结构存在。BMSCs+KLK1+黄芪组:观察在瘢痕中有外来移植细胞存在:有的细胞较长,胞核大,两边钝圆,类似心肌细胞的椭圆形核(成纤维细胞,其核呈梭形),内常染色质与异染色质共存,并且常染色质比例较高,细胞浆不丰富,内有线粒体与较多刚发育的肌丝,排列不规则。2.KLK1 mRNA含量表达:与BMSCs组比较,BMSCs+KLK1组和BMSCs+黄芪组的KLK1 m RNA含量表达水平均上调;与BMSCs+黄芪组比较,BMSCs+KLK1组的KLK1 mRNA含量表达水平上调。与BMSCs+KLK1+黄芪组比较,BMSCs+KLK1组mRNA含量表达水平上调,BMSCs+黄芪组的mRNA含量表达水平下调;与BMSCs+5-AZA组比较,BMSCs+KLK1组的KLK1 mRNA含量表达水平上调;而BMSCs+黄芪组差异无统计学意义。KLK1蛋白表达:与BMSCs组比较,BMSCs+KLK1组和BMSCs+黄芪组的KLK1蛋白含量表达水平均上调;与BMSCs+黄芪组比较,BMSCs+KLK1组的KLK1蛋白相对表达量水平上调;与BMSCs+KLK1+黄芪组比较,BMSCs+KLK1组的蛋白含量表达水上调,而BMSCs+黄芪组的蛋白表达量较低;与BMSCs+5-AZA组相比较,BMSCs+KLK1组的KLK1蛋白表达水平上调,BMSCs+黄芪组的KLK1蛋白含量表达水平下调。3.缓释肽B2型受体mRNA的表达:与BMSCs组比较,BMSCs+KLK1组和BMSCs+黄芪组的缓释肽B2 mRNA含量表达水平均上调;与BMSCs+黄芪组比较,BMSCs+KLK1组缓释肽B2 m RNA含量水平上调明显;与BMSCs+KLK1+黄芪组比较,BMSCs+KLK1组缓释肽B2 m RNA含量表达水平上调,BMSCs+黄芪组差异无具有统计学意义;与BMSCs+5-AZA组比较,BMSCs+KLK1组的缓释肽B2 mRNA含量表达水平上调,BMSCs+黄芪组的缓释肽B2 mRNA含量表达水平下调。缓释肽B2蛋白的表达:与BMSCs组比较,BMSCs+KLK1组和BMSCs+黄芪组的缓释肽B2 m RNA蛋白相对表达量达水平均上调;与BMSCs+黄芪组比较,BMSCs+KLK1组缓释肽B2蛋白相对表达量水平上调明显;与BMSCs+KLK1+黄芪组相比较,BMSCs+黄芪组的缓释肽B2蛋白含量表达平下调明显,,而BMSCs+KLK1组差异不具有统计学意义;与BMSCs+5-AZA组比较,BMSCs+黄芪组的缓释肽B2蛋白含量表达平下调明显,,而BMSCs+KLK1组差异无统计学意义。4.钾离子通道蛋白的表达:Kv1.2蛋白的表达:与BMSCs组比较,BMSCs+KLK1组和BMSCs+黄芪组的Kv1.2蛋白相对表达量达水平均上调;与BMSCs+黄芪组比较,BMSCs+KLK1组Kv1.2蛋白表达水平上调明显;与BMSCs+KLK1+黄芪组比较,BMSCs+黄芪组比较的Kv1.2蛋白含量表达下调明显,BMSCs+KLK1组的Kv1.2蛋白含量表达下调明显;与BMSCs+5-AZA组比较,BMSCs+黄芪组的Kv1.2蛋白含量表达下调明显,BMSCs+KLK1组,差异无统计学意义。Kv1.5蛋白的表达:与BMSCs组比较,BMSCs+KLK1组和BMSCs+黄芪组的Kv1.5蛋白相对表达量达水平均上调;与黄芪+BMSCs组比较,BMSCs+KLK1组的Kv1.5蛋白表达量上调明显;进一步分别比较,与BMSCs+KLK1+黄芪组比较,BMSCs+KLK1组蛋白表达量上调明显,BMSCs+黄芪组蛋白表达量水平下调明显;与BMSCs+5-AZA组比较,BMSCs+KLK1组蛋白表达量水平上调明显,BMSCs+黄芪组的蛋白表达量水平下调明显。结论:1.KLK1对心肌梗死后的心脏组织恢复有积极治疗作用;2.KLK1转染BMSCs对心肌梗死后心功能的恢复起着相当重要的作用,但是联合黄芪注射液两者之间无协同作用;3.5-AZA在治疗心肌梗死时确有疗效,但其自身毒性作用不容忽视,甚至毒性作用是妨碍心肌细胞复原的因素之一;4.BMSCs移植后对心肌梗死模型下心脏组织的保护用中,KLK1优于5-AZA。