BmNPV orf60缺失后的ODV定量蛋白质组学及Bm60乙酰化修饰的研究

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家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)是α杆状病毒Group I中的一员,也是危害家蚕(Bombyx mori)病毒中研究最为广泛的一类。Bm60蛋白是一种晚期蛋白,由BmNPV T3 orf60基因编码,前期研究已证明:(1)orf60基因缺失后出芽型病毒(budded virus,BV)的产量降低一个数量级,同时,病毒毒力降低,几乎无法观察到包涵体衍生型病毒(occlusion-derived virus,ODV)的囊膜;(2)感染BmNPV T3的细胞的蛋白乙酰化组学发现,Bm60蛋白发生乙酰化修饰。因此,本研究主要就orf60缺失后ODV的定量蛋白质组学及Bm60蛋白的乙酰化修饰进行研究。主要结果如下:1.orf60缺失后ODV的定量蛋白质组学分析(1)构建C端融合Flag标签的回补型病毒Bm60Rep,利用不同病毒蛋白的抗体进行Western blot,结果显示,orf60基因缺失后,P74、PIF1、PIF2、PIF3、PIF5、ODV-E66和VP39等病毒蛋白仍能在细胞中表达,但PIF1和PIF3两者表达异常。(2)ODV定量蛋白质组学结果显示,Bm60蛋白是ODV组分蛋白之一,orf60基因缺失后,多个定位于ODV囊膜的病毒蛋白含量发生变化;同时,多个与感染相关的病毒蛋白的含量也降低,如F样蛋白、PIF3、Bm121、CHITINASE。这些结果表明,Bm60蛋白作为ODV的一个组分蛋白,可通过影响ODV囊膜蛋白在ODV上的含量,导致ODV囊膜形态异常,进而影响病毒经口感染能力。2.Bm60蛋白的乙酰化修饰研究(1)构建Bm60的瞬时表达载体和重组杆粒,核质分离和Western blot实验结果表明,Bm60蛋白在感染病毒和瞬时表达时均存在乙酰化修饰。(2)构建去乙酰化的点突变体,免疫沉淀和Western blot实验结果显示,Bm60蛋白的乙酰化修饰位点为K236位点。(3)构建可观察荧光的乙酰化突变体病毒,以MOI为5感染BmN细胞,绘制病毒生长曲线,结果表明,K236位点的乙酰化状态不影响病毒的增殖能力。
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